Глава 10.

ФИТОБИОТЕХНОЛОГИЯ

Фитобиотехнология — составная часть биотехнологии. Объек- тами ее являются клетки и ткани растений — фотоавтотрофных эукариот, а также биоактивные молекулы растительного проис- хождения (ферменты, нуклеиновые кислоты, стероиды и некото- рые другие сложные органические вещества). Следует обратить внимание на тот факт, что растительные клетки в культуре обычно являются хемогетеротрофамй.

Название фитобиотехнология слагается из четырех слов гре- ческого происхождения: рЬу1оп — растение, Ъюз — жизнь, 1екеп — искусство, 1одоз — наука, слово. Следовательно, это наука об использовании растительных объектов в технике и промышленном производстве. На первый взгляд выращивание растений (злаковых, лекарственных, декоративных и т. д.) в полевых условиях подпадает под рубрику "фитобиотехнология", однако, как и с животными, здесь отсутствуют специфические методы промышленного куль- тивирования цельных растений в биореакторах. Таким образом, к фитобиотехнологическим процессам относят те из них, которые базируются на клеточном уровне, если даже клетки несут генети- ческую информацию, воспринятую ими в результате генно-инже- нерного эксперимента.

Клетки и ткани высших растений, выращиваемые на питатель- ных средах т лгпго в строго контролируемых условиях, все шире используют в фитобиотехнологии. Общирное царство растений — потенциально неограниченный источник клеток и тканей, которые могут быть введены в культуру и, как следствие, существуют неограниченные возможности для создания новых фитобиотехно- логических процессов, в которых нуждается человечество.

В настоящее время царство растений на земном шаре включает порядка 300 ООО видов. От рационального и бережного отношения к растениям зависит благополучное выживание человечества на планете Земля.

Представители царства растений (Р1агх1ае)

Надцарство — Еисагуоъа •

Царство — Р1ап1ае Отделы: 1. Водоросли — А1дае

Типы: а) Красные — Ипос1орпу1а .

б) Золотистые — Сшу5орЬу1а.

в) Желтозеленые — ХапИюрпуъа

г) Диатомовые — ВасШапорпуга

д) Динофлагелляты и криптомонады — ОторпуШ

е) Бурые — Рпаоерпу1а

ж) Зеленые — СЫогорЬу1а

з) Эвгленовые — Еид1епорпу1а Некоторые биологи выделяют дополнительный (девятый) тип пиррофитовых водорослей — Руггорпу1:а.

2. Печеночники и мхи — ВгуорЬуга

3. Папоротники, плауны и хвощи — Р1епсюрпу1а

4. Семенные растения — 5регта1:орпу1:а

Типы: а) Голосеменные — Сутпозреппае

б) Покрытосеменные (цветковые) — Апдюзрегтае.

В таком смысле фитобиотехнология является "палочкой-выру- чалочкой", способной освободить отдельные регионы и страны от импорта и интродукции растений, им не свойственных или совсем неспособных культивироваться в неподходящих климатических зонах. Это тем более резонно, когда речь идет о растениях — продуцентах БАВ.

Хотя растительные клетки и ткани принадлежат к более диф- ференцированным организмам в сравнении, например, с бактери- ями, тем не менее они способны культивироваться в форме неорганизованной клеточной массы (каллус). Каллусную ткань можно "заставить" формировать зародышеподобные структуры, почки, побеги, а на их основе — растения-регенерсшты. Все это происходит благодаря тотипотентности растительных клеток (от лат. 1оШз — все, целый, рогепиа — сила, потенция). Понятие "тотипотентность" является клеточной характеристикой; в нем отражен потенциал клетки воспроизводить все типы клеток, присущих взрослому организму. Другими словами клетка обладает способностью воспроизводить целый организм.

Если в качестве биообъекта применяют изолированный заро- дыш, меристему верхушечных или пазушных почек, то есть интег- рированную систему, то все получаемые растения-регенеранты будут полностью соответствовать исходному растению, из которо- го была взята какая-либо интегрированная система из числа вы- шеназванных. Этим добиваются клонирования интересующих нас растений (рис. 140).

Культуре ткани

Кчдукцхя роста ж быстро- го раямносекяя добавочных меристем (смблеаые юек- ен или. еародши] -непосред- ственно на родительской ткани» е такие через.про- межуточны* ввддус или суспетаконную культуру кжеток

1
.Б) стекле - мужской гаплоид	Растение - женский гаплоид		| Побег (-

Рис. 141. Пути искус- ственного создания но- вых форм растений (1 — трансгенез, 2 — хромо- сомная инженерия, 3 — генная инженерия. 4,8 — клеточная (геномная) ин- женерия, 5—7 — цибри- дизация).

В случаях применения изолированных клеток и протопластов удается получать измененные варианты исходной формы, которые передают полученные новые признаки потомству. Этим добивают- ся возможностей искусственного создания новых форм растений, пригодных для выборки, или селекции (рис. 141).

1

ядро

хромосома(-ы) 3

днк 4

Протопласт

_I

8

микроорганизм 7

митохондрия

6

протопласт

I

хлоропласт -

⁵ X

цктопласт

В течение последних трех десятилетий удалось массовое раз- множение культивируемых растений с уникальными характери- стиками, а выращивание растительных клеток стало основой для получения многих природных веществ, образуемых различными растениями в качестве продуктов вторичного обмена (гликозиды, алкалоиды и другие вещества).

Таким образом, клеточная и молекулярная биология растений составляет основу фотобиотехнологии, а главными направлениями стали создание новых форм полезных растений для сельского и лесного хозяйства, а также разработка промышленного производ- ства химических веществ из растений.

В сравнении с микробной биотехнологией фитобиотехнология является совсем молодой научной дисциплиной, становление ко- торой на промышленные рельсы происходит в настоящее время.

491

Для нее характерна и своя терминология, совпадающая или не совпадающая с общепринятой в биотехнологии в целом. Отдельные термины типичны для фитобиотехнологии. Примеры некоторых из них приведены ниже.

ЮЛ Термины, используемые в фитобиотехнологии

Адаптация — приспособление наследственно компетентной клетки (организма) к изменившимся условиям существования.

Адвентивный — развитие из необычных точек происхождения, например почечные или корневые ткани, возникающие из каллуса, или зародыши, развивающиеся из других источников, а не из зигот. Этот термин также может быть использован для описания агентов, загрязняющих клеточные культуры.

Аксеническая культура — культура без чужеродных или Н€Р желательных форм жизни; аксеническая культура может включать запланированное сокультивирование различных типов клеток, тка- ней или организмов:

Андрогенез — процесс развития растения из микроспоры, или пыльцевого зерна, либо через гаметический эмбриогенез, либо из каллуса.

Анеуплоид — организм, клетка, ядро с числом хромосом, отклоняющимся от х и от чисел, кратных х; хромосомы могут/не могут перестраиваться.

Апекс — верхушка.

Апикальное доминирование — подавление роста боковых почек растительного побега или наличие терминальной почки.

Апикальная (верхушечная) культура почечная — структура, состоящая из почечной апикальной меристемы с одним — до нескольких примордиальных листьев и обычными размерами от - 0,1 до 1 мм в длину; если включаются более зрелые листья, то такая структура может достигать в длину нескольких сантиметров.

Апикальная меристема почечная — недифференцированная ткань, локализованная в пределах верхушечной почки, представ- ляющаяся обычно в виде блестящей куполоподобной структуры, дистальной к самому молодому листовому примордию и размером менее, чем 0,1 мм в длину при вырезании.

Асептические процедуры (методы, техника работы) — проце- дуры, обеспечивающие предотвращение попадания микробов в клетки, ткани и органы растительных культур, или перекрестное загрязнение одной клеточной культуры другой. Эти процедуры могут/не могут исключить занесение инфицирующих молекул.

492

Асептическое состояние — состояние без инфекции или мик- робов-контаминантов.

Бессмертие—приобретение ограниченной во времени клеточ- ной культурой признаков непрерывной клеточной линии. Бессмер- тная клетка не обязательно та, которая неопластически, или зло- качественно трансформируется.

Вариант — культура, проявляющая стабильное фенотипиче- ское изменение — генетическое или эпигенетическое по природе.

Вегетативный рост — воспроизведение растений, используя бесполый процесс (части стебля или листьев).

Время генерации клетки — интервал времени между двумя последовательными делениями клетки. Этот интервал может быть лучше определен с помощью кинофотомикрографии (цейтрафер- ная съемка); этот термин не является синонимом "времени удвое- ния популяции".

Время удвоения популяции — интервал времени, в течение которого число клеток в популяции возрастает вдвое; другими словами — это интервал, соответствующий логарифмической фазе роста, за который, например, число клеток 1 • 10⁶ увеличивается до 2 • 10⁶ клеток. Этот термин не является синонимом термина "время генерации клетки".

Габитуация — приобретенная способность популяции клеток расти и делиться независимо от экзогенно добавляемых ростовых факторов.

Гаметоклон — растение, регенерированное из клеточной куль- туры, произошедшей из мейоспоры, гаметы или гаметофита.

Гаметоклональная вариация — вариация в фенотипе, либо генетическая или эпигенетическая по природе, выраженная гаме- токлонами.

Гаплоид — ядро, клетка, организм с половинным набором хромосом (п или 1п).

Гетерокарион—клетка, содержащая два или более генетически различных ядер в общей цитоплазме (обычно является результатом слияния клеток).

Гетероплоид — термин относится к клеточной культуре, в которой клетки обладают ядрами, содержащими иное число хро- мосом в сравнении с диплоидным числом (2п). Данный термин используют только для описания культуры, а не отдельных клеток. Следовательно, гетероплоидная культура должна быть той культу- рой, которая содержит анеуплоидные лслетки.

Гибридная клетка — термин используют для описания моно-

493

ядерной клетки, произошедшей из слившихся двух различных клеток с образованием синкариона.

Гиногенез — процесс возникновения растения из клеток заро- дышевого мешка.

Гомокарион — клетка, содержащая два или более генетически идентичных ядер в общей цитоплазме (результат слияния клеток).

Дедифференциация — переход специализированных, неделя- щихся клеток к пролиферации.

Диплоид — состояние клетки, в которой все хромосомы (за исключением половых) находятся в удвоенном числе (2п) и струк- турно идентичны хромосомам видов, от которых произошла куль- тура.

Дифференциация— комплекс процессов, в результате которых наступают различия между дочерними клетками, а также между материнскими и дочерними клетками.

Дифференцированные клетки — клетки в культуре, в которых поддерживаются все или многие из специализированных структур и функций, типичные для этих клеток т угуо; другими словами дифференцировка — состояние специализации клеток, отличаю- щее их от других.

1п упго — опыты, выполненные в пробирке, колбе и т. д., то есть вне живого организма.

1п У1УО — опыты, проведенные на живом организме.

Индукция — инициация структуры, органа или процесса т лагго.

Инокулюм (трансплант) —часть суспензионной или каллусной культуры, переносимой в свежую питательную среду.

Каллус ■— неорганизованная, пролиферирующая масса диффе- ренцированных растительных клеток.

Кариопласт — клеточное ядро, полученное из клетки посред- ством энуклеации, окруженное узким ободком цитоплазмы и клеточной мембраны.

Кариотип — набор хромосом, характерный для данного вида.

Клеточная линия — возникает из первичной культуры при первом удачном субкультивировании; название "клеточная линия" относится к таким культурам, которые включают линии клеток, изначально присутствующих в первичной культуре. Если известен статус культуры, то используют термины "прерывная" или "непре- рывная" культура. Если же статус неизвестен, то достаточен термин "линия".

Клон — популяция клеток, вози и китих из одной клетки посред-

|'м

ством митоза или группа растений, развившихся вегетативным или бесполым Путем, все члены которой произошли из одной повторно культивируемой клетки.

Клоналыюе микроразмножение — получение т лагго неполо- вым путем растений, генетически идентичных исходному.

Криоконсервация — сохранение клеток, тканей, зародышей или семян при ультранизкой температуре (ниже -100°С).

Культура зародышей — стерильное выращивание т лавго на/в питательной среде незрелых или зрелых изолированных зароды- шей.

Культура изолированных протопластов — выращивание про- топластов на/в среде ш лагго в присутствии стабилизатора. При регенерации клеточных стенок культура протопластов трансфор- мируется в клеточную культуру.

Культура каллусных тканей — длительно выращиваемая пе- ресадочная культура тканей, возникших вследствие пролиферации клеток изолированных фрагментов органов или самих органов растений (пыльники, семяпочки и т. д.).

Культура корней — выращивание т лагго на питательной среде изолированных корней в пересадочном режиме.

Культура меристем побега — выращивание т лагго на пита- тельной среде изолированного из верхушки или пазушной почки побега конуса нарастания с одним или двумя листовыми примор- диями, с первоначальным размером менее 0,1 мм в длину.

Культура-нянька — рост клетки или клеток на подлежащей культуре различного происхождения, которая в свою очередь находится в контакте с культуральной средой. Культивируемая клетка или ткань может быть отделена от питательного слоя пористым материалом — фильтрованной бумагой или мембранны- ми фильтрами.

Культура опухолевых тканей — длительная культура фрагмен- тов, изолированных из опухолей растений разного происхождения и освобожденных от патогенов, индуцировавших развитие опухо- ли.

Культуры тканевые — общий термин, который относят к изучению клеток, тканей и органов, поддерживаемых или выра- щиваемых 1п лагго в течение свыше 24 часов. Обычно используют следующие варианты термина: клеточная культура — растущие дп лагго клетки, включая культуру из одиночных клеток; в клеточных культурах клетки не организуются в ткани; тканевая культура — поддержание роста тканей т лагго в состоянии, при котором может

495

происходить дифференциация и сохранение их строения и/или функции; органная культура — поддержание или рост органного примордия или целого (или части) органа т лагго в состоянии, при котором может происходить дифференциация и сохранение стро- ения и/или функции; культура растительной ткани — рост или поддержание растительных клеток, тканей, органов или целых растений т лагго.

Линия — культура, возникшая из штамма путем селекции или клонирования, имеющая маркерные признаки (см. также "клеточ- ная линия").

Липосома —, закрытый липидный пузырек, содержащий вод- ную фазу; используют для включения экзогенных веществ, достав- ляемых в клетки посредством слияния липосом с клетками.

Микроклетка — клеточный фрагмент, содержащий одну — несколько хромосом и который образуется при энуклеации или разобщении микроядерной клетки.

Микрокультивирование — т лагго клональное культивирова- ние растений из почечных верхушек или узловатых эксплантов, обычнее ускоренной пролиферацией почек в течение субкульти- вирования.

Микроядерная клетка — клетка с блокированным митозом и в которой малые группы хромосом функционируют как фокусы для переустройства ядерной мембраны, формируя таким образом микроядра, максимум которых должен быть равен общему числу хромосом.

Морфогенез: а) развитие структуры от недифференцирован- ного состояния к дифференцированному; б) процесс роста и развития дифференцированных структур.

Мутаген — фактор, обусловливающий мутацию.

Мутант — фенотипический вариант, возникший в результате действия измененного или нового гена.

Мутация — генотипическое и необратимое (наследуемое) из- менение нормы реакции клетки (организма).

Непрерывная клеточная культура — культура, способная к неограниченному числу удвоения популяции; часто ее называют "бессмертной культурой" клеток. Такие клетки могут или не могут проявлять ю лагго свойства неопластической или злокачественной трансформации.

Норма реакции организма — проявление фенотипа в разных условиях существования вида.

Омнипотентность — всесильность.

496

Органогенез—процесс дифференциации в каллусных клетках, сопровождающийся образованием органов (корней, побегов) йе поуо или из предсуществующих структур.

Пассаж — перенос или пересадка клеток (с разведением или без разведения) из одной культуральной емкости в другую. Этот термин является синонимом термина "субкультура", а число пере- носа клеток или субкультур равнозначно числу пассажей.

Первичная культура — культура, берущая начало от клеток, тканей или органов, взятых непосредственно от организмов. Пер- вичная культура может расцениваться таковой до тех пор, пока не удаются субкультуры в первое время. Затем она становится "кле- точной линией".

Плотность насыщения — максимальное число клеток в куль- туральном сосуде при специальных условиях выращивания. Плот- ность насыщения выражается числом клеток на 1 см² в монослой- ной культуре или числом клеток на 1 см³ в суспензионной культуре.

Плотность популяции — число клеток на единицу поверхности или объема среды. Общее число удвоений популяции (уровень удвоения популяции) клеточной линии или штамма за один пассаж т лагго определяют со времени посева в расчете на одно удвоение: N0* = 1п (N/N0 х 3.33), где N — число клеток в культуральной сосуде на конечный период роста, Ы₀ — число клеток, засеянных в культуральный сосуд, N0* — число популяционных удвоений. Луч- ше всего использовать число прикрепившихся клеток.

Полиплоид — ядро клетки, организм с умноженным основным числом хромосом (Зх, Ах и т. д.).

Популяция клеток — совокупность клеток в культуре.

Примордий — первый, первичный.

Пролиферация — разрастание клеток и тканей путем размно- жения.

Пропагула — общий термин для обозначения органов и тканей, служащих для вегетативного размножения (синоним термину "ди- аспора").

Протопласт — клетка с удаленной клеточной стенкой.

Псевдодиплоид — клетка, в которой число хромосом является диплоидным, но в результате хромосомных перестроек нарушают- ся нормальный кариотип и родственные связи.

Регенерация — морфогенетический ответ на стимул, который приводит к образованию органов, зародышей или целых растений.

Редифференциация — переход специализированных клеток из одного состояния дифференцировки в другое с предшествующими

497

делениями или непосредственно.

. Рекон — жизнеспособная клетка, реконструированная слияни- ем кариопласта с цитопластом.

Реконструированная клетка — синоним термина "рекон".

Ростовый цикл — рост популяции клеток в цикле периодиче- ского выращивания, характеризуется 5-образной кривой. Фазы ростового цикла: латентная, экспоненциальная, замедд^ения роста, стационарная, деградации.

Синкарион — гибридная клетка со слившимися ядрами.

Сомаклональная вариация — фенотипическая вариация среди соматических клонов генетической или эпигенетической природы.

Соматическая (парасексуальная) гибридизация — слияние т лагго растительных протопластов соматических клеток, которые различаются генетически.

Соматический клеточный гибрид — клетка или растение, возникшее от слияния протопластов соматических клеток, разли- чающихся генетически.

Соматический клон, или соматоклон — растение, возникшее из любой формы клеточной культуры растительных соматических клеток.

Соматический эмбриогенез — образование эмбриоидов (заро- дышевых структур) в культурах клеток и тканей способом, напо- минающим нормальный зиготический эмбриогенез; другими сло- вами соматический эмбриогенез — это процесс эмбриоинициации и развития из вегетативных или не гаметических клеток.

Стадии по Мурасиге: I — культивирование т лагго, характери- зующееся посадкой растительной тканевой культуры в асептиче- ских условиях; II — ступень в культивировании т лагго, характе- ризующаяся быстрым численным возрастанием органов или дру- гих структур; III — ступень культивирования т лагго, характери- зующаяся приготовлением пропагулы для успешного переноса в почву; при этом происходит процесс укоренения и отвердения растений, начинается переход от гетеротрофного к аутотрофному состоянию; IV — ступень в культивировании ш лагго, характеризу- ющаяся посадкой в почву растительной тканевой культуры, или после претрансплантной обработки материала (пропагул) в стадии III, либо (для некоторых видов) после прямого переноса растений из стадии II в почву.

Субкультивирование — перенос транспланта (инокулюма) на свежую питательную среду.

Субкультура — см. термин "пассаж".

498

Субпротопласт — протопласт, потерявший часть цитоплазмы.

Субштамм — происходит из штамма при изоляции одиночной клетки или группы клеток, обладающих свойствами или маркера- ми, которыми не обладают все клетки родительского штамма.

Суспензионная культура — тип культуры, в которой клетки или их агрегаты размножаются, будучи суспендированными в жидкой питательной среде.

Сферопласт — клетка с неполностью удаленной клеточной стенкой.

Тотипотеитность — клеточная характеристика способности к формированию всех клеточных типов взрослого организма, или это — свойство соматических клеток растений полностью реали- зовать свой потенциал развития, то есть реализовать омнипотент- ность ядра с образованием целого организма.

Трансгенез — перенос любым способом чужеродных генов в клетки растений.

Трансформация—введение и устойчивая геномная интеграция чужеродной ДНК в растительной клетке, сопровождающаяся ге- номной модификацией.

Фенотип — определенная сумма признаков организма в конк- ретных внешних условиях.

Цибрид — жизнеспособная клетка, возникшая в результате слияния цитопласта с клеткой — протопластом или цитопластом; при этом образуется цитоплазматический гибрид.

Цибридизация — введение цитоплазматических (внеядерных) генов в изолированный протопласт.

Цитоплазматическая наследственность — наследственность, обусловленная внеядерными генами или хлоропластными, плаз- мидными и т. д.

Цитопласт — интактная цитоплазма, остающаяся после энук- леации (удаление ядра) клетки.

Штамм — происходит из первичной культуры или клеточной линии при селекции или клонировании клеток, имеющих специ- фические свойства или маркеры.

Эксплант — ткань, взятая из своего оригинального места и перенесенная в искусственную среду для роста и поддержания.

Эмбриоид — зародышеподобная структура, возникшая путем соматического эмбриогенеза.

Эмбриокультура — т лагго развитие и поддержание изолиро- ванных зрелых или незрелых зародышей.

Эпигенетические вариации — фенотипическое выражение

499

дифференциальной активности генов, определяющих независи- мость клетки от экзогенных влияний. В отличие от сомаклональных вариаций и мутаций не сохраняются в цикле "клетка -» растение —> клетка".

Эуплоид — ядро, клетка, организм с числом хромосом, крат- ным х.

Ювенильный (-ая, -ое) — фаза в половом цикле растения, характеризующаяся различиями (в проявлении) от взрослого ор- ганизма, и которая теряет способность отвечать на индуцирующие цветение стимулы. Это фаза роста после образования проростков.

10.2 Вегетативное размножение растений методом культур тканей. Метод культур тканей, или микроразмножение ш лагго исключительно удобен для быстрого размножения и сохранения здоровых растений. Для этого производят отбор соответствующих эксплантов, подвергают стерилизации с последующим переносом на подходящую питательную среду. Качество эксплантов зависит от вида и фазы развития растения; органа, из которого взят эксплант; сезона года. Установлено, что меристемные ткани, сер- дцевина луковиц, клубнелуковиц и корневищ, надежно защищен- ные листьями и чешуйками, являются стерильными. Перед удале- нием покрывающих структур их каждый раз протирают 70% этанолом. Открытые органы — источники эксплантов подвергают стерилизации ртуть- или хлорсодержащими агентами (таблица 50).

Как видно из таблицы, самая длительная стерилизация по времени не превышает 40 минут, в других случаях время заметно меньше. В усредненном варианте и применительно к различным культурам растительных тканей, наряду с этанолом (70-»-95%), рекомендуют еще серебра нитрат (1%), бензалконий хлорид (0,01—' 0,1%) с длительностью экспозиции 0,1—5; 5—30 и 5—20 минут соответственно.

Экспланты (за исключением материала из надземных частей растений) целесообразно промывать в растворах неионогенных ПАВ перед обработкой дезинфектантом. После этого ткань тща- тельно промывают водопроводной водой в течение 10—30 минут, а затем погружают в раствор дезинфектанта и нерезко взбалты- вают в течение отведенного времени. После стерилизации расти- тельный биообъект трижды промывают свежими порциями сте- рильной дистиллированной воды.

Стерилизующий эффект можно повысить следующими проце- дурами: проведением стерилизации- под вакуумом для удаления пузырьков воздуха; помещением материала в 70% этанол до того, как обработать раствором другого дезинфектанта; использованием таких увлажняющих агентов как твин 80 или твин 20 в виде добавок к растворам дезинфектантов для снижения поверхностного натя- жения и обеспечения более полного контакта дезинфектанта с материалом.

В последние годы все чаще применяют специальные емкости (сосуды) для изоляции в асептических условиях органов из молодых растений. Фирма Зддта (США) к 1990 г. ввела новые мембранные наборы для культур растительных тканей. Их изго- тавливают из микропористой полипропиленовой мембраны, обра- ботанной специальным ПАВ для улучшения прохождения пита- тельных веществ. Мембранные наборы могут быть использованы при культивировании протопластов, в соматическом эмбриогенезе, при получении культур цветов и в других направлениях.

С применением мембран существенно ускоряется рост в срав- нении с агаризованной средой, лучше удается освобождать куль- туры от ингибирующего влияния фенольных веществ, выделяю- щихся в среду, а также предохранять клеточную линию от суще- ственных повреждений при изучении метаболитов, продуцируе- мых культурами, и др. Таким путем удается уменьшить расход материалов и, как следствие, снизить цены, поскольку культуры -могут поддерживаться в течение длительного времени без замены культуральных контейнеров. Ингредиенты (продукты) для культи-

501

вирования растительных тканей должны производиться в соответ- ствии с требованиями СМР. Этим гарантируется их высокое качество. Пригодность ингредиентов сред обеспечивающих рост тканевых культур, оценивают, как минимум, на трех клеточных линиях в 1—3-х пассажах. Избранные основные среды дополняют углеводами, витаминами, регуляторами роста (в зависимости от используемой клеточной линии).

Применяют следующие критерии оценки роста на рекоменду- емой питательной среде (таблица 51).

Т а б л и ц а 51. Критерии оценки роста клеточных культур на питательных средах

Культуры тканей
Каллусная	Почечная пролиферирующая	Другие клеточные линии
Возрастание веса каллуса	Активное образование почек или растеньиц	Активно растущий каллус
Отсутствие некротической ткани	Образование сильных здоровых почек .без морфологических аберраций	Увеличение плотности клеток
Внешне — активный рост	—	Выраженный рост почек и корней

Питательные среды стерилизуют обычно в автоклавах (таблица 52). В принципе желательна стерилизация автоклавированием (121 °С) небольших объемов питательных сред, поскольку многие ингредиенты разрушаются при более продолжительном нагрева- нии и давлении. Установлено, что температура выше 121°С может быть причиной нарушения качества сред, и, как следствие, плохого роста культур.

Некоторые ингредиенты в растворенном виде стерилизуют фильтрованием (через фильтры с порами 0,22 мкм в диаметре) и в виде стерильных растворов вносят в приготовленные среды перед их использованием. Питательные среды по своему составу доста- точно разнообразны, однако в какой-то мере они и однообразны. В частности, их компоненты можно подразделить на 3 группы: источники органического углерода (чаще — сахароза), неоргани- ческие соли (включая источники азота) и стимуляторы роста. К числу последних относятся некоторые витамины комплекса В и растительные гормоны — цитокинины и ауксины. Почти универ- сальной средой для клеток различных видов является среда М5 Т. Мурасиге и Ф. Скуга (см. главу 4). Тем не менее, при работе с разными растительными объектами необходим специальный под- бор ингредиентов сред для достижения поставленных целей. Пи- тательные среды могут быть плотными за счет внесения 0,7—1% агар-агара и жидкими. Показано, например, что для микрокультуры ананасов предпочтительнее жидкие среды.

Микроразмножение т упго можно осуществлять из существу- ющих в растении тканей меристемного типа (зародыш, верхушка основного побега) или позже образующиеся пазушные побеги, равно как и из дополнительных меристематических тканей (точки роста, эмбриоиды) изолированных органов растений, где они формируются непосредственно в родительской ткани; из проме- жуточного каллуса или клеток суспензионных культур (см. рис. 140).

Если в качестве источника углерода используют в питательных средах сахарозу, то фотосинтез не нужен культуре, однако для морфогенеза и биосинтеза хлорофилла применяют люминесцент- ные лампы с интенсивностью освещения 1000—5000 люкс.

Важную роль играют регуляторы роста растений — аукси- ны и цитокинины (растительные гормоны, или фитогормоны). Первые усиливают или поддерживают рост каллу-

503

сов и/или корнеобразование ш лагго; вторые стимулируют образо- вание почек Их используют в малых концентрациях, добавляя в стерильном виде к готовым питательным средам.

Ауксинами являются: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, р- хлорфеноксиуксусная кислота, индол-3-уксусная кислота, индол- З-ацетил-Ь-аланин, индол-3-ацетил-аспарагановая кислота, индол- З-ацетил-Ь-фенилаланин, индол-3-ацетилглицин, индол-3-масляная кислота и ее калиевая соль, а-нафталинуксусная кислота. Среди цитокининов известны: лденин, 6-бензиламинопурин, М-бензил-9- (2-тетрагидропиранил) -аденин, 6-у-у-диметилаллиламинопурин, 1,3-дифенилмочевина, кинетин, зеатин и некоторые другие. Сме- шанными функциями обладают абсцизовая, коричная и гибберел- ловая кислоты, флороглюцинол; 2,2-диметилгидразид янтарной кислотыТ

В целях предотвращения возможного бактериального и гриб- ного загрязнения к ним добавляют такие антибиотики, как полиены (амфотерицин В, нистатин), карбенициллин, цефалоспорин и его производные, левомицетин, аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин моносульфат), рифампицин и др. Большинство антиби- отиков неустойчиво при нагревании, поэтому их растворы стери- лизуют фильтрацией через мембраны. .

Для растений характерно так называемое апикальное домини- рование, при котором за счет регулирующего действия фитогор- монов верхушечная почка развивается быстрее, чем пазушные почки. Если культивировать кончик побега без фитогормонов, то развивается одиночный проросток со строго апикальным домини- рованием. Если же в среду внести цитокинин и засеять пазушные побеги, то они вырастают недоразвитыми, но с появлением пучка ростков, состоящего из второго, третьего и более порядков, кото- рые можно разделить на составляющие и вновь выращивать на свежей среде до получения пучков таких побегов. Этот процесс можно вести до бесконечности, получая быстро или относительно быстро размножающиеся побеги желаемых растений.

В большинстве случаев верхушечные (длиной 1—5 мм) и па- зушные побеги заражены растительными вирусами, поэтому при- бегают к использованию так называемой культуры верхушечных меристематических тканей, когда отрезают лишь 0,3—0,5 мм верхушки, содержащей меристему и 1—2 листовых примордия с последующей выдержкой при 30—40°С в течение 1,5—3 меся- цев. Этот метод удачно использован и используется для оздоров- ления хозяйственно ценных растений.

504

С помощью метода культур тканей удалось значительно повы- сить коэффициент размножения многих садовых древесных (яб- лони) и травянистых декоративных растений (ирис, нарцисс, пе- туния, фиалка и др.), пользуясь придаточными побегами, а также каллусами, индуцированными фитогормонами и дающими побеги или эмбриоиды. Доступными для производства стали клетки бар- бариса — продуцента спазмолитика ятроризина, табака — проду- цента убихинона-10.

Некоторые каллусы стабильно продуцируют растения — реге- нераты в течение 10 лет (табак, хризантемы и др.), оставаясь при этом смесью нерегулярно дифференцированных клеток, среди которых постоянно содержатся диплоидные меристематические клетки, дающие стеблевые апексы или зародыши.

Перед высадкой проростков в грунт прибегают к стимуляции корнеобразования с помощью индолилмасляной кислоты (0,5—г 10 мг/л).

Фитобиотехнологи, занимающиеся микроклональным размно- жением растений, должны быть хорошо подготовленными в обла- сти биологии растений, с которыми приходится иметь дело, а также в области микробиологической техники работы. Лишь благодаря заинтересованности и профессиональному подходу к выполнению задания обеспечивается высокое качество конечного продукта (материала). Тем не менее необходимо помнить о трудностях, возникающих при микрокультивировании. К ним относятся: ин- фицирование растительных тканей вирусами и фитопатогеннымй бактериями (например, Еплата саго1о\Уога), бактериальные и гриб- ковые контаминации, ингибирование тканей фенольными и дру- гими, например, летучими, соединениями, возрастание числа му- таций, и пр. И все же микрокультивирование исключительно заманчиво не только на пути создания большого количества без- вирусного " материала, но и массовости получения образцов в относительно короткие сроки (несколько тысяч в течение месяцев).

Микрокультивирование т \а1го обеспечивает быстрое вегета- тивное размножение не только травянистых, но и древесных растений, также прибегая при этом к культуре побегов (например, для декоративных, лесных, плодовых и других деревьев) или каллусным культурам (гвинейская масличная пальма, цитрусовые и др.). Здесь важное значение имеет состояние ювенильности (от англ. ]1п/ет1е — юношеский, юный), которое обычно растягивается на несколько лет и характеризуется сравнительной легкостью вегетативного размножения. Для древесных растений известно

505

также явление реювенильности, когда некоторые ткани взрослого растения проявляют свойства проростков, например, формируют придаточные корни. Реювенилизированные ткани все больше ис- пользуются на практике для размножения отдельных покрытосе- менных (например, эвкалиптов) и голосеменных деревьев (разные виды сосны). Ускорение реювенилизадии может происходить под влиянием отдельных фенольных соединений (флороглюцин, квер- цетин, рутин), памятуя о том, что изменение уровня эндогенных фенольных соединений является составной частью регуляторных процессов, индуцируемых цитокининами.

Каллусные культуры древесных растений также перспективны как и каллусные культуры травянистых растений. Показателен

он о

флороглюцин кверцетин

остаток ©-Э" 1-рамнозндо-О-глюкозы рутин

пример с гвинейской масличной пальмой (Е1ае1в дшпеепв18) — источником получения масла для населения Юго-Восточной Азии, Америки, Африки. К тому же эта пальма не размножается вегета- тивно. Генетико-селекционная работа по выведению более уро- жайных сортов на основании полового размножения занимает 15—20 лет. Вот почему получение каллусов, а затем — эмбриоидов и регенерантов масличной пальмы оказалось экономически выгод-

506

Учитывая тот факт, что в 1 см³ каллусной культуры содержится до 1 млн. клеток, каждая из которых способна трансформироваться в новое растение, становятся понятными все преимущества метода стерильного вегетативного размножения растений в лабораторных условиях-на средах с фитогормонами при последующей пересадке их в почву. Отбирая нужные клетки, можно вывести новые сорта растений, удовлетворяющие запросы по одному или ряду показа- телей (устойчивость к микробным заболеваниям, урожайность, особая окраска цветов, повышенная продуктивность вторичных метаболитов и т. д.).

Для развития и формирования каллусных культур значительна роль не только фитогормонов, но и так называемых э л и с и т о- р о в (от англ. е!ес1 — выбирать) — БАВ, дерепрессирующих гены, и, как следствие, активирующих клеточные деления, сравнительно быструю дедифференцировку специализированных клеток, сопро- вождающуюся активацией белкового синтеза. Полагают, что зли- ситорами являются углеводные молекулы, происходящие из гид- ролизованных гликанов клеточных стенок. Не исключена возмож- ность экзогенного происхождения элиситоров, например, от мик- роорганизмов.

10.3. Культивирование клеток растений в глубинных услови- ях. В случае выращивания клеток растений в глубинных (погру- женных) условиях необходимо иметь такие их линии, которые отвечали бы следующим требованиям: склонность к размножению в дезагрегированном со- стоянии, морфологическая "выравнен- ное т ь", удовлетворительная скорость раз- м н о ж е н и я, сохранность путей метаболиз-

507

м а. Такие клеточные линии уподобляются одноклеточным мик- роорганизмам и могут называться "суспензионными культурами" в случае их выращивания в жидких питательных средах. Состав и реологические характеристики сред являются основными факто- рами, определяющими нахождение одиночных или аггломериру- ющихся (агрегирующихся) клеток во взвешенном состоянии. Если число клеток в аггломератах превышает 50, то они могут выпасть (или выпадают) в осадок. Желательно, чтобы в процессе размно- жения клетки дольше оставались в разобщенном состоянии, тогда поддержание суспензионной культуры в течение необходимого времени оказывается вполне достижимым.

Что касается морфологической "выравненности" клеток, то при этом имеют в виду их округлую (или сферическую) форму, уплот- ненную цитоплазму, сравнительно небольшие размеры (в среднем, от 10 до 50 мкм) и отсутствие трахеидоподобных элементов. Одиночные растительные клетки в таких случаях напоминают одноклеточные эукариотические микроорганизмы; их ростовые характеристики (фазы размножения) в некотором приближении также оказываются совпадающими (1ад-фаза, 1од-фаза, сопаЬфаза, 1е1-фаза), хотя временные интервалы между фазами более растя- нуты для клеток растений.

Скорость размножения растительных клеток невелика—время удвоения их числа равно 1—3 суткам и поэтому по данному показателю они существенно уступают, например, бактериальным и дрожжевым клеткам, время удвоения которых в глубинных условиях укладывается для большинства видов в 20—30 минут. Однако, переводя культуру растительных клеток на хемостатноё (непрерывное) выращивание, можно добиться их высокой продук- тивности По биомассе или по вторичным метаболитам (пример с Мсоиапа 1аЬасит).

Исходные клеточные суспензии обычно получают из рыхлых, оводненных каллусных тканей (2—3 г на 60—100 мл питательной среды), подвергнутых обработке пектиназой и полигалактурона- зой, и помещаемых в жидкую питательную среду, лишенную ионов кальция, но содержащую ауксин — 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту. Условия выращивания поддерживают либо в периодиче- ском, либо в непрерывном режиме, специально подобранном для конкретного биообъекта. В других случаях источниками суспензи- онных культур могут быть протопласты с реконструированными клеточными стенками. Стимулировать деления отдельных клеток изолированных протопластов можно с помощью обогащенных

508

питательных сред или использованием гомологичной ткани — "няньки" ("кормящий слой"), находящейся в состоянии активного роста (рис. 143). Колонии из отдельных клеток (клоны) могут быть субкультивированы один или более раз (при необходимости), а затем переведены в суспензионные культуры.

Рис. 143. Использование тка- ни-"няньки" (суспензионная куль- тура) при выращивании колоний из одиночных клеток кукурузы или протопластов (схема): 1 —качалоч- ная колба, 2 — колония, возникшая из отдельной клетки, 3 — фильтро- вальная бумага. 4 — металлическая сетка, 5 — суспензия клеток "кор- мящего слоя", 6 — подложка (пе- нополиуретан), 7 — питательная среда.

Важно также сохранить присущие клеткам метаболические пути при их выращивании в суспензионных культурах. Более того, регулируя обмен, можно добиваться заметного повышения выхода целевых продуктов. При этом всегда необходимо учитывать тип дифференцировки, или состояния специализации исходных клеток, так как от него зависит видоспецифичность первичного и вторичного метаболизма.

Суспензионные культуры обычно выращивают в подходящих емкостях роллерного типа после фильтрации первичной суспензии через стерильные металлические, нейлоновые или марлевые сита для освобождения от крупных аггломератов клеток.

К сожалению, выращивание растительных клеток в "погружен- ных" условиях пока удается в редких случаях, что обусловлено недостаточной глубиной познания всех особенностей обмена ве- ществ у различных видов и их клеточных культур; определенные помехи здесь связаны и с медленным ростом клеток в строго асептических условиях, их чувствительностью к механическим повреждениям и другими причинами. .'_

В начале 80-х годов в компании МЙ5ш-Реих>спеписа11п<1ив1пев осуществлен первый крупномасштабный процесс по выращива- нию воробейника (И&озрептшт егуШгогЫгоп) в погруженных условиях в целях получения вторичного метаболита — шиконина,

509

являющегося ценным фармацевтическим препаратом и красите- лем (рис. 144). За один периодический процесс удается получать порядка 5 кг конечного продукта, накапливающегося в клетках. На первой стадии клетки воробейника выращивают на среде (с пода- чей стерильного воздуха) в 200-литровом биореакторе в течение 9 суток; затем культуру переносят в биореактор меньшего размера со средой (М-9), стимулирующей продукцию шиконина, и, нако- нец, в третьем реакторе на 750 л ферментацию ведут в течение 2 недель. Клетки на первой стадии белые, на последней — красные (накоплен шиконин). Стоимость красителя в 1983 г. составляла 4000 долларов за килограмм.

D+C

Рис 144. Схема культи- вирования воробейника в це- лях получения шиконина (1 — биореактор, 2 —■ подача стерильного воздуха, 3 — ме- шалка, 4 — питательная сре- да, 5 — выпуск отработанно- го воздуха, 6 — перенос сре- ды в малый реактор, 7 — фильтрат, 8 — красные клет- ки, содержащие шиконин).

10.4. Использование методов генетической инженерии, или рДНК в фитобиотехнологии. Растения — как многоклеточные организмы с огромной емкостью геномов, с половым путем раз- множения и многоступенчатыми программами развития — явля- ются более сложными объектами для генноинженерных экспери- ментов, чем, например, вирусы, бактерии и дрожжи. Тем не менее, уже теперь достигнуты определенные успехи с растительными объектами и по прогнозам ученых США к 2000 году ожидается прирост урожайности сельскохозяйственных культур примерно на 60% по сравнению с началом 80-х годов текущего столетия в основном на основе использования методов генетической инже- нерии, когда стал возможным перенос отдельных генов от одного растения другому (в противоположность естественному половому процессу, при котором происходит замена целых блоков сцеплен- ных генов).

10.4.1. Генная инженерия. Плазмиды, органеллы, транспозоны и вирусы как векторные системы. В генноинженерном экспери- менте необходимо изолировать конкретный ген, включить его в наследственный аппарат растительной клетки и регенерировать фертильное растение (способное к размножению) с измененным

510

наследственным признаком. В народнохозяйственном аспекте важ- ными признаками являются: высокая урожайность (или продук- тивность), скороспелость, устойчивость к различного рода заболе- ваниям, засухе, к гербицидам и пестицидам, неполегаемость и др. К сожалению каждый из названных признаков контролируется, как правило, группой' генов, что заметно усложняет проблему клонирования соответствующих генов. Однако, природа с давних пор "доказывает" нам, что генетическая инженерия также подвла- стна и ей. Примером тому служит инфекционная злокачественная болезнь (корончатые галлы) многих двудольных растений, вызы- ваемая почвенной агробактерией — АдгоЪас1епит 1итеГас1еп8.Та- кие однодольные растения, как пшеница, кукуруза, овес, рис, рожь, сахарный тростник, естественно устойчивы к заражению агробак- териями.

В 1971 г. Р. Гамильтон и М. Фолл (США) пришли к выводу о том, что опухоль у растений индуцируется нуклеиновой кислотой. В 1974 г. Н. Ван Ларебеке, П. Энглер и др. (Бельгия) установили, что способность А.1итеГас1епа вызывать образование корончатого галла с большими по размерам плазмидами (в длину 50—80 мкм в разомкнутом состоянии и с ММ 112—156 МДа — мегадальтон), названными II- плазмидами (от англ. тшпог тйистд — вызывающий опухоль). Обычно они в клетке содержатся в 1—2 копиях и составляют примерно 4% ДНК от бактериального генома.

Однажды наведенный "П-плазмидой опухолевый рост у расте- ния не нуждается в ее дальнейшем присутствии для поддержания злокачественной пролиферации. Следовательно, выращивание и поддержание опухолевых клеток возможно в стерильной культуре (без агробактерий и без "П-плазмиды), и, как установлено, без ауксинов и цитокининов, то есть без фитогормонов. При этом они образуют опины (см.), отсутствующие у растений в нормальных условиях, и по которым можно определять опухолевую клетку. В зависимости от клеток корончатого галла могут образовываться агропин (см.), нопалин (см.) или октопин (см.). Поэтому и говорят соответственно: клетки агропинового, нопалинового или октопи- нового типа.

Фактическая ненужность "П-плазмиды после индукции опухоли у растения связана с тем, что стерильные опухолевые клетки в своих хромосомах содержат ковалентно связанную часть этой плазмиды (около 10%), получившей название Т-ДНК (от англ. ггапзГеггес! — перенесенный), а применительно к клеткам

5Н

А.ште1а.слеп8 с ТЬплазмидой — Т-участок бактерии. Т-ДНК содер- жится исключительно в ядре клеток корончатого галла.

Таким образом, на примере Т1-плазмиды виден перенос генов от прокариот к эукариотическим растениям в природных условиях (рис. 145). Транскрипты интегрированной Т-ДНК в виде мРНК поступают из ядра в цитоплазму клетки, где включаются в реакции синтеза специфических белков на полирибосомах: ядерная ДНК- Т-ДНК —> транскрипты —» мРНК —> полирибосома (трансляция) —» белки —> синтез опинов (гормон-независимый рост)

1 2 4 5 Рис. 145. А. Схема пере-

'^/6 в растение с последующим '. формированием корончатого

*^ галла (1 — бактериальная

АвгоЬасипит Растительная клетка Растение с корон- хромосома, 2 — Т-ДНК, 3 —■ ШтеГасЕепа с встроенной Т-ДНК чатыи галлом Т1-плазмида, 4 — ядро расти-

в ядерную ДНК тельной клетки, 5 — встроен-

ная Т-ДНК, 6 — корончатый галл); Б. Т-ДНК в ТЬплазмиде октопинового типа (продук- Б -В В ~ая Т-ДНК ты генов 1 и 2 ингибируют

— — = .—■— -транскригпы побеги, гена 3 — ингибируют

корни).

Каждый транскрипт определяется специфическим промотор- ным участком на Тьплазмиде, узнаваемым полимеразой II растения — хозяина. Из рисунка 145 Б следует, что функция генов 1—3 проявляется в неорганизованном росте клеток, поскольку тормо- зится формирование побегов и корней.

Фитопатогенные агробактерии способны вызывать 3 вида ра- ковых опухолей у растений: корончатый галл, бородатый корень и стеблевой галл. Возбудителем каждого заболевания являются АЛитеГаоепз, А-гЫзодепев и А.шЫ соответственно. Проникая в поврежденное растение, патогенный микроорганизм с помощью Тг-плазмиды создает свою экологическую нишу и реализует "гене- тическую колонизацию" объекта — происходит гормон-независи- мый рост опухолевых клеток.

ТЬплазмиды оказались хорошими векторными системами для осуществления генноинженерных экспериментов с растениями, поскольку Т-ДНК этих плазмид обладает достаточно высокой эффективной емкостью (порядка 50 ООО пн чужеродной ДНК могут быть перенесены и встроены с ее помощью в хромосомную ДНК

512

растений), широким спектром хозяев, инфекционностью и ста- бильностью.

Перенос гипотетического гена с помощью "П-плазмиды пред- ставлен на рис. 146.

Рис. 146. Перенос гена (а) из хромосомы (б) ЕвсЬепсЫа соЦ в растение (5) с помощью Т-ДНК (в) ТЬплазмиды (г) А.гшпеГааепв (2.3) в ядерную ДНК (д) расти- тельной клетки (4).

Разработаны векторные системы на основе растительных хло- ропластов и митохондрий, ДНК которых имеют гомологичные области с ядерной ДНК, что облегчает обмен участками между ними при выполнении генноинженерных экспериментов.

Заманчивы в качестве векторных систем й транспозоны (см). Их множество сулит многообещающие результаты в опытах с однодольными растениями, устойчивыми к заражению агробакте- риями и, следовательно, к восприятию Т-ДНК ТЬплазмиды.

В качестве векторов могут также использоваться вирусы рас- тений. Их нуклеиновые кислоты реплицируются и проявляют свои функциональные свойства (экспрессируют) в клетках растений- хозяев, где потенциал вирусов и воспринимающих клеток объеди- няется и реализуется в приумножении организованных частиц патогена (например, для вируса мозаики табака в среднем 10⁷ частиц на клетку, для вируса мозаики цветной капусты — порядка 10⁴ частиц на клетку).

Однако вирусы как векторы обладают четырьмя существенны- ми недостатками: они патогенны, их емкость небольшая, вирусы не способны встраиваться в хромосомы растительных клеток, они, в основном, видоспецифичны, то есть поражают определенный круг растений — хозяев.

В качестве векторов могут быть использованы также и вироиды (см.), представляющие собой однонитевые цепи ковалентно свя- занных кольцевых РНК, включающих 270—300 нуклеотидов, ли- шенных оболочки. Вироиды поражают виноград, картофель, коко- совую пальму, томаты и другие растения как по вертикали (через 17 т. 8524 513

зародышевые клетки), так и по горизонтали (распространяются по растительному организму через клеточный сок или переносятся механически).

Ч тобы использовать вирусную (вироидную) РНК в качестве вектора, необходимо выполнить следующие последовательные опе- рации (рис. 147).

РНК вирус* (ввроида)

кДНК С^ИОЛИТГЯЯН

«ДНК

Прокарнотичесгаш пламмда (может быть косинда) с «ДНК

Плазмида с

чужсродны»« геном а «ДНК

ШП1г—

Ряс 147. Последователь- ность событий при использо- вании вирусной (вироидной) РНК в качестве вектора: 1 — обратная транскриптаза, 2 ■— ДНК-полимераза, 3 — встра- ивание в плазмиду (клониро- вание), 4 — включение чуже- родного гена, 5 — инфициро- вание растений, 6 — транс- крибирование с образовани- ем инфекционной РНК и по- следующее заражение расте- ния-хозяина.

Клон кДНК с встроенным геном может обладать инфекцион- ностью и, как следствие, им заражают хозяйское растение. Если же кДНК с встроенным геном не обладает инфекционностью, то вирусный вектор может быть транскрибирован с образованием РНК, которая затем используется для заражения растения.

До сих пор признают, что векторная система на основе цитоп- лазматического вируса мозаики цветной капусты (содержит двух- цепочечную ДНК) оказывается наиболее приемлемой в генноин- женерных экспериментах с растениями, хотя многое здесь остается неизученным (например, молекулярные механизмы проявления симптомов заболевания растения-хозяина от поражения вирусом, неопределенность диапазона растений-хозяев" и возможность его расширения, неспособность векторной системы встраиваться в геном хозяина, и др.).

Если удается объединить возможности ДНК из вируса мозаики цветной капусты с Т-ДНК Тьплазмйды, то такую векторную сис- тему можно будет использовать на более широком круге растений- хозяев.

10.4.2. Использование методов геномной и хромосомной ин- женерии в фитобиотехнологии. Объединение геномов клеток разных особей можно осуществлять при половой и соматической гибридизации. Первая из них способна реализоваться в природных и искусственных условиях, тогда как вторая — только в искусст- венных. Половая гибридизация давно известна человеку, и он с тех пор использовал ее для выявления новых сортов растений и для повышения их продуктивности.

Соматическая гибридизация базируется в основном на приме- нении растительных протопластов, впервые полученных Дж. Клер- кером в 1892 г. из листьев 51га1ю1е8 а1о1с1е8 (водное растение, именуемое телорезом).

Соматические клетки растений, как и интактные клетки бак- терий или грибов (по лат. ппасШв — нетронутый), в обычных условиях не сливаются друг с другом. Все они предварительно должны быть лишены клеточной стенки и трансформированы в протопласты.

Протопласты (от греч. рго1оз—первый, р1а81оз—вылепленный, образованный) — это клетки, лишенные клеточных стенок, спо- собные сохраняться и метаболизировать, равно как и реконстру- ировать клеточную стенку в подходящих условиях. Протопласты можно получать с помощью механических и биохимических (эн- зиматических) методов. В первых случаях добиваются плазмолиза растительных тканей, например, с помощью 0,1% раствора саха- розы с последующим разрезанием эпидермиса и освобождением протопластов в окружающую питательную среду. Энзиматические методы по-разному эффективны в получении протопластов. Здесь необходимо подбирать ферменты для каждого вида растений, однако наиболее часто используют целлюлазы, пектиназы, геми- целлюлазы как индивидуально, так и в комбинациях. Например, для получения протопластов из листьев №соиапа 1аЪасиш листовую ткань без эпидермиса погружают в смесь ферментов, включающую 0,5% пектиназы и 2% целлюлазы в 0,7 М растворе маннита или сорбита; для получения протопластов из листьев клевера и люцер- ны используют 2—5% смесь гликаназ с пептидазами, и т. д.

В сравнительном плане более подходящим является энзимати- ческий метод получения протопластов как более щадящий. Однако при любом способе важен подбор осмотического стабилизатора,

515

без которого может наступить быстрый плазмоптиз¹ протопластов (по лат. р1а5та — плазма, ориоп — альтернатива). В качестве таких стабилизаторов могут быть применены растворы неорганических солей (СаС1₂, КС1, №₂НР0₄), органических гликолей (маннита, сорбита), моно- и дисахаридов (глюкозы, ксилозы, сахарозы) в ориентировочных концентрациях 0,3—0,8 М/л. Однако примени- тельно к виду растения, из которого получают протопласты, необ- ходимо подбирать индивидуальные условия для "протопластирова- ния" (осмотический стабилизатор, рН среды, г°С). Эти требования сохраняются и в случаях получения протопластов из каллусных культур и клеточных суспензий.

В жизнеспособности выделенных протопластов большую роль играет физиологическая полноценность исходного растительного материала. Суспензионные культуры наиболее приемлемы для этих целей, будучи в конце логарифмической фазы роста (размно- жения).

Полученные тем или иным путем протопласты либо используют для регенерации растения (см. тотипотентность), либо их можно подвергнуть слиянию с образованием гетерокариотических гибри- дов.

Из растений, относительно легко регенерирующих из протоп- ластов, можно назвать картофель, люцерну, маниок, рапс, табак. Для получения растений — регенерантов, высаженных в грунт, требуется, как минимум, 16—18 недель.

Растения, полученные из протопластов, могут отличаться до- статочно выраженной изменчивостью по ряду интересующих нас признаков: урожайности, величине (размеру), морфологии отдель- ных частей, фотопериодичности и др. Как правило, это связывают с изменением числа и перестройками хромосом. Поэтому протоп- ласты растений представляют собой интересные объекты и для изучения процессов мутагенеза.

Гибридизация протопластов удается не только в тех случаях, когда исходные растения (источники клеток для протопластирова- ния) способны гибридизоваться половым путем, но и тогда, когда заведомо известно, что клетки, подлежащие слиянию, относятся к организмам с половой несовместимостью. Тем не менее, во всех случаях соматической гибридизации один из партнеров должен нести какой-либо маркерный признак (биохимический или дру-

гой), по которому возможно подтвердить достоверность получения гибрида. В этом смысле удобны ауксотрофные мутанты.

Гетерокариотические соматические гибриды выделяют либо вручную с помощью микроманипулятора, капиллярной пипетки и шприца, либо автоматически на основе применения флуоресцен- тных систем.

Для биотехнологии также важна цибридизация, когда возника- ют гетерозиготы по внеядерным (цитоплазматическим) генам, определяющим, например, устойчивость к гербицидам или признак цитоплазматической мужской стерильности (рис. 148).

Рис. 148. Слияние

растительных протопла- стов и возможная сегре- гация хлоропластов: 1 и 2 — протопласты разной видовой принадлежно- сти, 3 — гетерокарион, 4 — гибриды, Г и 2' — цибриды.

К настоящему времени из ряда растительных протопластов получены их безъядерные фрагменты — микропласты, окружен- ные тонопластной мембраной и включающие часть внеядерного генетического материала. Используя приемы соматической гибри- дизации, микропласты можно сливать с реципиентными протоп- ластами. Таким образом, микропласты являются резервным мате- риалом для расширения возможностей клеточной инженерии в фитобиотехнологии. Более того, теперь удается гибридизация рас- тительных протопластов с протопластами микроорганизмов и жи- вотными клетками.

Применительно к хромосомной инженерии удалось доказать проникновение изолированных метафазных хро- мосом в обработанные полиэтиленгликолем реципиентные протоп- ласты таких однодольных растений, как пшеница и кукуруза.

Открываются пути привнесения дополнительной генетической информации по желанию экспериментатора в целях создания трансгенных растений. Прямой перенос чужеродной ДНК в про- топласты возможен также с помощью микроинъекции, трансфор- мации, упаковки в липосомы с последующим их эндоцитозом растительными протопластами, и электропорации (высоковольт- ных электрических импульсов).

10.4.3. Генная инженерия и биологическая фиксация азота. Азотистые удобрения, вносимые в почву (наряду с другими пита- тельными веществами) стимулируют рост и развитие растений. Обогащению почвы азотом помогают особые микроорганизмы, фиксирующие молекулярный азот из воздуха. Такие микробы подразделяют на две группы — свободноживущие в почве (напри- мер, Аго1оЪас1ег спгоососсит) и микробы - симбионты с корневой системой растений (например, КЫхоЪшт теШотл). Те и другие осуществляют биологическую азотофиксацию. Число азотофикса- торов невелико, но от них в буквальном смысле слова зависит жизнь на нашей планете. С помощью микробов - азотофиксаторов ежегодно фиксируется около 17,5 • 10⁷ т N2 из воздуха. Основные компоненты системы азотофиксации являются сильными восста- новителями: ферментный комплекс — нитрогеназа, ферредоксин или флаводоксин и АТФ. Микробы — азотофиксаторы трансфор- мируют молекулярный азот в аммиак по следующей схеме:

+2Н

ЫН ^ип2 "^п2

М₂ ^Ф2Н » Н 0^2*^2МН3

Ассоциация клубеньковых бактерий из рода КЫшЪшгя с бобо- выми растениями является наиболее эффективной по фиксации N2 из воздуха. Ответственными за это являются тГ-гены. Соответ- ствующие биопрепараты бактериальных удобрений (см. главу 9) выпускают в различных странах мира.

К настоящему времени практически решена проблема увели- чения шГ-генов в микробах — азотофиксаторах, являющихся сим- бионтами донника (РЛ. теЫои). За счет этого заметно усиливается азотофиксация и, как следствие, повышается урожайность расте- ния — хозяина (рис. 149).

Рис. 149. Схема получения клеток ШйгоЪшт теШог!, несущих дополнитель- ные гены азотфиксации: 1 — плазмидная ДНК, 2 — рестриктаза, 3 —■ клетка ШцпеШоЫ, 4 — хромосома клетки, 5 — пИ-гены, 6 — лигаза, 7 — рестриктирован- ная плазмидная ДНК, 8 — плазмидная ДНК с шГ-геном, 9 — трансформация, 10 — клетка Кп.теШои с тГ-генами.

Имеются также предпосылки к созданию методами генной инженерии злаковых растений — азотофиксаторов. Это сулит большие выгоды агрохозяйствам, занимающимся выращиванием, например, зерновых культур.

Прибегают и к простым искусственным ассоциациям азото- фиксирующих бактерий с растениями, дающими ощутимые ре_г зультаты по урожайности (например, цианобактерии АпаЬоепа уапаЪШз и табака).

10.4.4. Другие прикладные аспекты фитобиотехнологии. В начале 80-х годов текущего столетия удалось создать подсолнечник, несущий гены бобов фасоли, кодирующих белок фазеолин. Такое химерное растение получило название "Санбин" (от англ. зип — солнце, Ъеап — боб), оно способно синтезировать во многом полноценные белки. Каллусная культура санбина также обладает этой способностью.

Кроме генов фазеолина локализованы и выделены гены таких запасаемых белков, как зеин — белок кукурузы и легумин — белок гороха. Эти гены удается переносить в отдельные негомологичные растения.

Создан трансгенный рапс, содержащий гены отдельных ней- ропетидов человека, например, лей-энкефалина, связанного с геном альбумина семян рапса. С одного гектара земли, засеянного таким рапсом, можно получать до 3 кг нейропептида.

Важное значение имеют работы по созданию гербицидоустой- чивых растений, не боящихся сорняков. Удалось перенести из представителей актиномицетов ген устойчивости к фосфинотри- ацину в клетки сахарной свеклы; получены также устойчивые к гербицидам определенные сорта табака.

Токсические белковые кристаллы, образующиеся в клетках Вас. 1Ьиппд1еп515 на основе матричного синтеза, убивают личинок листогрызущих насекомых. Поэтому генноинженерная разработка по переносу гена бактериального токсина в геном табака увен- чалась успехом в 1987 г. Экспрессия такого гена сопровождалась

биосинтезом токсина, и личинки насекомых, поедающие листья, погибали в сравнительно короткий промежуток времени. По тако- му же принципу был создан инсектицидный трансгенный хлоп- чатник, содержащий ген ингибитора трипсина гороха коровьего; этот ген обусловливает синтез белка, блокирующего протеолити- ческую активность в пищеварительной системе у насекомых.

Создан новый сорт помидоров, длительно сохраняющийся без размягчения вследствие подавления активности фермента полига- лактуронидазы. Методом генной инженерии получен ген, опреде- ляющий биосинтез анти-мРНК, которая ингибирует природную мРНК.

Благодаря удачному переносу генов фермента хальконсинте- тазы (в антйсмысловой ориентации) в петунию удалось получить растение с белыми цветами.

Сконструированы такие генноинженерные сорта сои, которые проявляют устойчивость к насекомым, гербицидам, вирусам и образуют больше запасных белков, обогащенных метионином.

На основе методов геномной инженерии получены межвидо- вые гибриды капусты, картофеля и табака с турнепсом, картофеля с помидором ("Помат"), помидора дикого вида, устойчивого к некоторым вирусам, и культурного сорта.

Успешными оказались работы по созданию морозоустойчивых растений на основе их обработки культурой клеток Рзеисютопа» зуппдае, из которой элиминирован ген, ответственный за синтез специального белка, ускоряющего кристаллизацию воды с образо- ванием льда. Обработка клубйей картофеля таким "лед-минус" микробом приводит к возрастанию их морозоустойчивости.

. 10.5. Получение биогаза и удобрений на основе использования растений. Традиционные методы гибридизации растений помогли достигнуть резкого повышения их урожайности (особенно — зерновых культур); наступила так называемая "зеленая револю- ция", с которой, например, в странах Юго-Восточной Азии связы- вают полное самообеспечение продуктами питания.

Возрастание урожайности культур растений сопряжено с уве- личением их отходов. Одна часть таких отходов может быть использована в качестве корма для сельскохозяйственных живо- тных, другая — для биотрансформации в какие-либо полезные продукты (биогаз, удобрения и пр.). Рациональное использование растительных отходов помогает решать отдельные экологические и энергетические проблемы.

10.5.1. Получение метана из растительных отходов. Метан (СН*) входит в состав природных газов (на него приходится 97—98% в природных газовых месторождениях). Так называемые "попут- ные нефтяные газы" из буровых скважин содержат 39—85% мета- на, «стальные газы представлены, в основном, этаном, пропаном, бутанами, пентанами.

В воздухе каменноугольных шахт всегда присутствует метан в примерных количествах 3,5—7,5%. Смесь метана с воздухом сильно взрывается от пламени.

Метан образуется также в природе при бактериальном разло- жении клетчатки или в рубце жвачных животных (метановое брожение), при окислении молекулярного водорода до СН₄ (анаэ- робное дыхание).

Метановое брожение происходит в анаэробных условиях под влиянием смешанной микрофлоры, включая метанобразующие бактерии, или бактерии — метаногены (археобактерии, см. главу 2).

В настоящее время миллионы биогазовых установок в Индии, Китайской Народной Республике, в странах ЕЭС рассчитаны на проведение метанового брожения в одном биореакторе (метантен- ке) емкостью от одного до нескольких тысяч кубометров.

10.5.2. Получение кормового белка на основе биоконверсии целлюлозосодержащих растительных материалов'. Давно изве- стен биотехнологический процесс получения дрожжей на гидро- лизатах древесины хвойных растений. В такой древесине содер- жатся гексозаны, тогда как в древесине лиственных растений — преимущественно пентозаны, почти совсем не сбраживаемые по- сле гидролиза дрожжевыми организмами.

В качестве гидролизующих агентов используют кислоты или, реже, ферментные комплексы. В любом случае матричный лигнин остается негидролизованным и от него стремятся избавиться пред- варительной делигнификацией целлюлозных материалов различ- ными способами, в том числе — паракрекингом, или обработкой водяным паром под давлением 7—8 ати. Можно использовать биологический способ делигнификации, когда на целлюлозосодер- жащем материале выращивают дереворазрушающие грибы из класса базидиомицетов. Эти последние делают целлюлозный ма- териал доступным в качестве корма для жвачных животных (со- держание лигнина в нем не должно превышать 18—20%).

Делигнифицированная целлюлоза становится более доступной, например, для целлюлазного комплекса гриба Тпспойегта лапйе,

521

обогащающей белком этот продукт при твердофазной фермента- ции.

Получение кормовых дрожжей на гидролизатах древесины и сульфитных щелоках (отходах целлюлознобумажной промышлен- ности), приведено в главе 9. Здесь рассмотрены биотехнологиче- ские процессы использования растительной массы.

Технология получения ферментированного сока и белкового коагулята из зеленой массы растений.

Названная технология может быть реализована по так называ- емой схеме ТПФ-1, предложенной М. Е. Бекером (Латвия). Для этого используют свежеекошенную зеленую массу клевера и люцерны, которую измельчают лацератором, прессуют на прессе (например,Т1-ВПО-30), жом передают на приготовление травяной муки с добавлением антиоксидантов, либо — на силосование. Натуральный травяной сок подают в биореактор для непрерывной анаэробной ферментации, где он обогащается белком и за счет органических кислот консервируется естественным путем.

Сухие вещества в ферментированном соке составляют 5—10%, сырой протеин — 1—3%, общее количество органических кислот — 1—2%, рН 3,9—5,4.

Кислотообразующие бактерии дополняют сок метионином. Вместе с тем в соке снижается количество сапонинов и ингибитора трипсина.

Кроме ферментированного сока по этой биотехнологии пол- учают белковый коагулят, содержащий 10—20% сухого остатка (в сухом остатке содержится 25% сырого протеина).

Из нижнего штуцера биореактора коагулят отбирают периоди- чески (1 раз в 1—2 суток) в количестве 20—30% от поданного натурального растительного сока. На сброженный сок приходится 70—80% объема от натурального сока. Его подают по трубопрово- дам либо в кормушки животным (прежде всего имеющим однока- мерный желудок), либо в другой биореактор, где на нем выращи- вают специальные расы кормовых дрожжей из родов Напяепша и Тпсповрогоп, с помощью которых конечный продукт вдвое обога- щается истинным белком.

Способ ТПФ-1 пригоден для мелких и крупных агрохозяйств, располагающих электроэнергией; он нетрудоемок и экономически выгоден, а получаемый сброженный сок представляет собой вы- сококачественный кормовой продукт (таблица 53).

522

Силосование кормов давно используют на практике и силос занимает важное место в рационе сельскохозяйственных живо- тных. На первых порах использовали примитивные силосные ямы, куда вносили свежескошенную траву (нередко грубую, плохо поедаемую в естественном виде жвачными животными). Ямы герметизировали и за счет природной эпифитной микрофлоры происходила твердофазная ферментации травы. Нередко такие ферментации были неудачными из-за нерегулируемости желатель- ной микрофлоры (молочнокислых бактерий) и преобладания гни- лостных процессов.

В последующем были сконструированы и внедрены в сельско- хозяйственную практику силосные бащниили процесс силосования начали вести в специальных траншеях, в которых стало возможным осуществление направленных процессов с помощью специальных бактериальных заквасок. Используемые закваски различаются по содержащимся в них видам. Например, препарат "Казахсил ПБК" включает только пропионовые бактерии, латвийская закваска — чистую культуру 1дстх>Ъасши5 р1ап1ашт и т. д. По консистенции закваски подразделяют на три группы: сухие, уплотненные, жид- кие. Содержание сухих веществ в них составляет для первых —

более 90%, для уплотненных — 45—65% и для жидких — 5—10%. Наилучшими из них признают жидкие закваски, в которых кон- центрация живых клеток равна 1 • 10⁹/мл. Тогда для траншейного силосования растительной массы в количестве 500 т необходимо от 500 дО 1000 л закваски.

Недостатки жидких заквасок: температура хранения должна быть в пределах 4—8°С; малый срок хранения при указанной температуре — не более двух недель; необходимость больших емкостей в случае силосования большого количества растительной массы, и, в этой связи, заметные транспортные расходы для перевозки жидких заквасок (особенно — на дальние расстояния). Поэтому сухие и уплотненные закваски выгоднее жидких, если реактивация микробных клеток при рекомендуемых температурах (чаще при 20—25°С) происходит в короткие сроки и полностью (т. е. почти 100% клеток).

Молочнокислые бактерии индуцируют соответствующее бро- жение с накоплением молочной кислоты при снижении рН до 4,3 и ниже; это предотвращает развитие нежелательной микрофлоры (в том числе — эпифитной) и силос обогащается "природными" органическими кислотами — молочной и уксусной. С этим улуч- шается качество силоса, хотя и происходит определенная утрата сахаров, расходуемых в течение первой (спонтанной аэробной) и второй (индуцируемой анаэробной) фаз силосования.

До герметизации башни (траншей) трансформация углеводов протекает под действием не только вносимой закваски, но и. естественной микрофлоры растений, закладываемых на силосова- ние. В первую фазу имеют место гомо- и гетероферментативное брОжение, во вторую — преимущественно гомоферментативное, когда меньше образуется "побочных" продуктов (диоксида углеро- да, маннита).

В приготовлении силоса важное значение приобретает также равномерное распределение молочнокислых бактерий закваски в толще закладываемой растительной массы, а также применение таких химических консервантов, как муравьиная и бензойная кислоты, другие вещества. Консерванты предотвращают потери углеводов, (особенно — в первую фазу), а во вторую при рН 4,0 ингибируются нежелательные ферментативные реакции (в том числе — гниение). Более того, подобные консерванты улучшают качество конечного продукта — возрастает усвояемость корма. Из химических консервантов известны препараты АИВ-2, Фарми-ли- уос и др. АИВ-2 содержит 80% НСООН, 2% — Н₃Р0₄ и 18% Н₂0;

524

Фарми-лиуос включает 25% НСООН, 25% СН₃ СООН, 50% добавки, содержащей 35% "Финфермекса" (лигносульфонаты, пентаозы, гексаозы, соли кальция, магния, серы, железа, другие органические кислоты) и 15% других веществ.

10.5.3. Получение удобрений на основе ассоциации растений и микроорганизмов. Круговорот веществ в природе в значительной степени обусловлен и поддерживается за счет деятельности мик- роорганизмов, обеспечивающих доступность для растений азота, фосфора и других элементов. Запасы азота в природе практически безграничны и возобновляются благодаря микробам-азотофикса- торам. В то же время запасы фосфора менее богаты и легче истощаются, а для растений (как и для любого живого организма) данный элемент относится к разряду органогенов. Установлено, что фосфор в виде ортофосфата легче освобождается из трудно- доступных для растений соединений при действии микроорганиз- мов, потребляющих органические вещества. Здесь важны свобод- ноживущие азотофиксаторы, клубеньковые бактерии и грибы-ми- коризообразователи. При их рациональном использовании удается существенно повысить плодородие почвы для культивирования важных растений. В регионах земного шара с теплым климатом удается получать ценные удобрения на основе водяного папорот- ника (АгоНа ртпагл) и цианобактерии (АпаЬаепа врр.). Подобная симбиотическая ассоциация характеризуется тем, что она фикси- рует молекулярный азот из воздуха и обогащает почву раствори- мыми соединениями.

Показано, что подобное "зеленое удобрение" повышает уро- жайность риса на 50%, если его вносят в почву перед следующим посевом. Такой эффект, аналогичный использованию 60 кг азот- ного удобрения на 1 га, пролонгируется и в течение второго года.

Из представителей царства Мусо1а базидиальные грибы-мак- ромицеты связаны трофическими связями с различными растени- ями; прежде всего — древесными. Поэтому возможна и полезна искусственная микоризация (от греч. тукев — гриб, гЫга — корень) древесных культур макромицетами, например, при посад- ках. Около 40% всех видов макромицетов (порядка 5000) образуют эктомикоризу.

Поглощаемые корнями растения питательные вещества посту- пают также и в гифы грибов, где фосфор переходит в связанное состояние и в таком виде поступает в ткани деревьев. Фосфор возвращается в почву после отмирания "микоризных корней".

Динамика содержания фосфора в подстилке ( по лат.

525

БГгатепШт — солома; в лесу она состоит из опада и чаще — многолетнего) и дерново-подзолистом горизонте почв коррелирует в фенологическом смысле (фенология — наука о сезонных явле- ниях в живой природе) с динамикой плодоношения макромице- тов-микоризообразователей. Наибольшее количество плодовых тел и "подвижного" фосфора совпадают во времени и пространстве.

Макромицеты-симбиотрофы имеют большое экономическое и экологическое значение. Некоторые из них, например, из родов Ьассапа, РахШив, БиШив и др. используют для восстановления природных ценозов.

О симбиотрофии ризобактерий и растений (в частности, бобо- вых), об изготовлении ряда препаратов для удобрения почв см. главу 9.

10.6. Коллекционные центры сохранения генофонда растений.

Обычно для селекции использовали древние культурные растения и их сородичей. С ростом народонаселения на нашей планете и существенно возросшими потребностями в продуктах питания происходили сдвиги в сторону преобладания в севооборотах вы- сокопродуктивных современных сортов, например, злаковых рас- тений. К тому же включение все новых и новых площадей под посевы (особенно — на территории России) подвинуло нас ко времени, когда популяции диких предков, адаптировавшихся к конкретным условиям обитания, стали исчезать с "лица Земли". А это привело к оскудению генофонда растительного мира. Вот почему сегодня проблема его сохранения стала наиважнейшей.

В 1974 г. был образован Международный Совет по генофонду растений (1ВРСЯ), поддерживаемый РАО, Международным банком и за счет программы развития при ООН (1ЖОР). Цель этого совета — создавать и координировать международное сотрудничество по сохранению генофондов, и организовывать финансовую поддер- жку такого рода программ. В этой связи 1ВРСР. координирует работу по сбору, сохранению, документированию, оценке и ис- пользованию генофонда.

Генофонд растений можно сохранять в естественных условиях, то есть в местах их произрастания. Здесь важную роль играют природоохранные мероприятия, опирающиеся на соответствую- щие законодательства и законодательные акты, принятые в меж- дународном и региональном масштабах.

Другой путь сохранения генофонда — поддержание материала в так называемых банках генов. Такие банки могут быть рабочими и законсервированными. Первые используются генетиками и се-

526

лекционерами для своих непосредственных нужд и поэтому в них ) не всегда предусмотрено длительное хранение материала; они, как правило, небольшие по ассортименту растительных видов. Вторые относят к разряду крупных банков генов — в них сохраняют большой набор генотипов, включая и такие, ценность которых еще не определена, но над которыми нависла угроза исчезновения. Из законсервированных генофондов могут пополняться рабочие кол- лекции.

Особенно с т и банков генов: их целесообразность и широкий видовой набор сохраняемого материала, надежность способов хранения, своевременность обновления материала, фун- кциональный динамизм.

Что касается широты видового набора сохраняемого материала, то под этим понимают спектр сохраняемых генотипов, и чем он больше, тем богаче возможность человечества жить в прекрасном мире различных растительных сообществ, чем и определяется целесообразность создания банков генов. В этой связи можно отметить, что в генобанке (коллекции) в ВИРе (Всероссийский институт растениеводства) хранится 380000 генотипов растений.

Надежность способов хранения генофонда зависит от вида растения и сохраняемости материала (семена, вегетативная форма ткани, искусственные посадки), а также методов обработки и/или подготовки материала для хранения. В отношении большинства видов сельскохозяйственных культур приемлемым оказалось кри- осохранение семян в течение длительного времени. Если растения не образуют жизнеспособных семян или семян, не выдерживаю- щих длительного хранения (многолетние древесные растения), то стремятся сохранять относительно долго живые ткани в вегетатив- ной форме. При этом необходимо помнить о возможности возник- новения микробных болезней, обусловленных вирусами, бактери- ями, грибами. При ежегодном хранении вегетативных отводков травянистых растений существенная выбраковка происходит из-за легкости их повреждений.

Хранение в виде искусственных посадок, например, древесных растений, необходимы большие площади пригодных для этого земель и достаточно внимательный уход за посадками.

Из сказанного вытекает, что универсального способа сохране- ния генофонда не существует и, очевидно, его не может быть, учитывая разнокачественность видов в царстве растений. Наибо- лее надежным для семян признают криосохранение (от греч. кпов — мороз). Изучение влияния низких температур на

527

живые организмы составляет предмет науки "Криобиология". Кри- осохранение в буквальном смысле Означает хранение в заморо- женном состоянии. Точка замерзания чистой воды соответствует 0°С, точка переохлаждения, или образования однородных центров кристаллизации соответствует -38°С. На практике используют температуры значительно ниже, чем температура замерзания во- ды, например, -79°С (температура сухого льда), -80°С и ниже (температура в специальных морозильниках), -150°С (температура паров жидкого азота), -196°С (температура жидкого азота). Сохра- няемый биообъект переходит в анабиотическое состояние, когда метаболизм замедляется или приостанавливается на время хране- ния. При этом также не происходят какие-либо генетические изменения за исключением повреждающего действия ионизиру- ющей радиации.

В практике работы коллекций может наблюдаться так называ- емый холодовый шок, или повреждение от охлаждения, когда сохраняемый материал проявляет чувствительность к пони- женным температурам. При этом жидкая часть цитоплазмы выхо- дит из клеток из-за структурных нарушений в клеточной мембране. К счастью, холодовый шок не проявляется при криосохранении большинства типов растительных клеток.

При охлаждении клеток важную роль играет кристаллообра- зование льда вокруг внутриклеточных гетерогенных центров кри- сталлизации, когда образующиеся кристаллы могут физически повреждать, например, клеточные мембраны.

Методический подход к выбору способа замораживания зави- сит от качества материала (семена, вегетативная ткань, уровень их обезвоживания и пр.) На рис. 150 представлены данные Дж. Фарранта (1980) по выживаемости клеток при охлаждении.

Рис. 150. Выживаемость клеток при быстром и мед- ленном охлаждении; 1 — не- замерзшая клетка, 2 — точка замерзания, 3 — выход внут- риклеточной воды, 4 — быс- трое охлаждение — клетка не сжата, внутриклеточный лед, клетка не выживает, 5 - мед- ленное охлаждение — клетка сжата, нет внутриклеточного льда, клетка выживает.

Чтобы уменьшить образование внутриклеточного льда в про- цессе охлаждения клеток, используют криопротекторы (в концентрации около 2 М) с разным механизмом действия. Они снижают точки замерзания (точку плавления) и переохлаждения воды (температура, при которой происходит гомогенная кристал- лизация льда), поднимают точку девитрификации раствора (тем- пература, при которой происходит исключение аморфности, стек- ловидности и когда начинается внезапная кристаллизация). Рас- твор остается аморфным, когда он охлаждается быстро, то есть время, необходимое для роста кристаллов, ограничено. В этом случае говорят, что раствор витрифицируется. При медленном нагревании такого раствора происходит выделение тепла, совпадающее по времени и внезапной кристаллизацией или девитрификацией.

К числу криопротекторов относят глицерин, гликаны, гликоп- ротеины, ДМСО; сахарозу, ПВС, сыворотку крови и др. Их можно использовать по отдельности или в смесях. Лучший способ стери- лизации растворов криопротекторов — мембранная фильтрация.

При получении культуры после криосохранения в парах азота (-150°С) или в жидком азоте (-196°С) их оттаивание проводят достаточно быстро в водяной бане при 35—40°С. После оттаивания необходим тщательный уход за каждым образцом.

Установлено, что при криосохранении протопластов из многих видов растений достигают 70—90%-й их выживаемости. При соче- тании медленного и ступенчатого замораживания и быстрого оттаивания в качестве криопротектора рекомендуют 10% ДМСО.

Для криосохранения каллусов обычно применяют двух- или трехкомпонентную смесь криопротекторов: 8% глюкоза, 10% ДМСО и 10% ПЭГ (ММ 6 кДа).

В таблице 54 приведены различные типы культур растений и применяемые условия их хранения.

Среди факторов, лимитирующих рост отдельных растений, могут быть и ретарданты (от лат. ге1агс1айо — замедление), что отмечено, например, для меристематических тканей паслена.

Из таблицы 54 видно, что криосохранение в жидком азоте приемлемо для преобладающего числа указанных видов культур тканей растений.

Для суспензионных культур клеток нередко рекомендуют трех- компонентную двухмолярную смесь криопротекторов, включаю- щую глицерин (0,5 М), ДМСО (0,5 М) и сахарозу (1 М).

Необходимо иметь в виду, что методы криосохранения до сих пор остаются трудоемкими и дорогостоящими, однако "цели оп- равдывают средства".

Охлаждение суспензионных, каллусных и различных органи- зованных культур проводят обычно медленно (1—2^СС в минуту), меристематические ткани, напротив, охлаждают очень быстро (от 50° до более чем 1000°С в минуту); также быстро проводят завер- шающее охлаждение изначально медленно охлаждаемых образцов.

Материалом для первичного хранения образцов выбирают стекло, полипропилен, фольгу. К сожалению, стекло разных сортов нередко растрескивается, и поэтому оно уступает полипропилену

531

и фольге. Полипропиленовые ампулы с завинчивающимися крыш- ками стерилизуют заранее отдельно или их поставляют в стериль- ном виде. Из фольги готовят пакеты, поддающиеся стерилизации в автоклаве. К сожалению, абсолютно надежный способ сохране- ния любых образцов еще не разработан.