1.3.3 Характерні риси люмінесценції білків та їх складових
До складу більшості білків входять три ароматичні амінокислоти (Phe, Tyr, Trp), які визначають їх спектральні властивості. Електронна структура ароматичних амінокислот досить детально досліджена методами рентгенівської спектроскопії [63,64]. Ароматичні амінокислоти поглинають світло в діапазоні 240-300 нм, а випромінюють – 300-450 нм (рис. 1.3.3.1).
Рис. 1.3.3.1. Спектри випромінювання та поглинання ароматичних амінокислот рН7 у водному розчині [35].
Не зважаючи на те, що з усіх ароматичних амінокислот Trp міститься в білках в найменшій кількості (порядку 1%, одна чи кілька молекул на весь білок, через високі енергетичні затрати при його синтезі), саме він є основним флюорофором та характеризується значною чутливістю спектрів флюоресценції до оточуючого середовища.
У випромінюванні амінокислот домінує Trp, він же має найбільший коефіцієнт екстинкції (рис. 1.3.3.1). Енергія, що поглинається Phe чи Tyr, в ряді випадків переноситься до Trp [11, 35].
Фенілаланіну властивий найбільш короткохвильовий та структурний (порівняно з Trp та Tyr) спектр флюоресценції з максимумом близько 282 нм. Вигляд спектрів Phe не залежить від полярності середовища, як у випадку з Trp. Триптофан у свою чергу характеризується максимумом флюоресцентного випромінювання на довжині хвилі близько 350 нм і є дуже чутливим до змін в оточуючому середовищі.
Зазвичай флюоресценція більшості протеїнів збуджується випромінюванням з довжиною хвилі 280 нм. Оскільки квантовий вихід Phe порядку 0.03, то в білках його флюоресценція майже не спостерігається. За кімнатної температури в нейтральному водному розчині квантовий вихід Tyr та Trp відповідно становить 0.14 та 0.13 [35].
Зважаючи на те, що основний внесок у поглинання та люмінесценцію білків, вносить триптофан, розглянемо його спектральні властивості детальніше. Trp – це унікальний флюорофор з двома ізоенергетичними станами, з яких і реалізується випромінювання [35, 39].
У переважній більшості білків у флюоресценції проявляється випромінювання триптофану. Розташування максимуму випромінювання та квантовий вихід люмінесценції триптофану залежно від типу білка може значно змінюватися [65, 66]. Також вигляд спектрів люмінесценції триптофану значною мірою залежить від його просторового розташування в білковій молекулі (рис. 1.3.3.2) [35, 67].
Рис. 1.3.3.2. Вплив середовища на спектри випромінювання Trp. Спектри випромінювання apoazurin Pfl, ribonuclease T1, staphylococcal nuclease, glucagons від 1 до 4 відповідно [35]. |
Наприклад всі різновиди білка азурін мають різні спектри випромінювання, залежно від кількості триптофанових залишків та їх розташування в білковій молекулі. Azurin Pae містить одну молекулу Trp, яка міститься всередині білка в позиції 48; Azurin Afe містить одну молекулу, проте Trp в позиції 118 на поверхні білка; Azurin Ade – дві молекули Trp в позиціях 48 та 118 [35, 68].
1.3.4 Особливості процесів передачі електронного збудження в білкових макромолекулах
Перекриття спектрів поглинання та випромінювання ароматичних амінокислот (рис. 1.3.3.1) дають підстави вважати можливою передачу енергії між ними в білковій макромолекулі. В середньому глобулярний протеїн має вагу 50000 дальтон та містить порядку 450 амінокислотних залишків, приблизно 10 з них будуть ароматичні. Типова концентрація білка 1.4г/мл, а концентрація ароматичних амінокислот в ньому близько 0.28М=280мМ. Радіуси більшості білкових молекул становлять 24Ǻ [35].
У таблиці 1.3.4.1 подані розраховані фьорстерівські радіуси для ароматичних амінокислот.
Донор |
Акцептор |
R0(Ǻ) |
A0(Mоль/л) |
Phe Tyr Tyr Trp |
Tyr Tyr Trp Trp |
11.5-13.5 9-16 9-18 4-16 |
0.29-0.18 0.61-0.11 0.61-0.08 7.0-0.11 |
Таблиця 1.3.4.1 Розраховані значення радіусів Фьорстера для ароматичних амінокислот [35].
У ряді випадків енергія передається від Tyr до Trp. Більшість білків містять ці два типи ароматичних амінокислот і вони обидві легко збуджуються довжиною хвилі λзб=275 нм. Одним з яскравих прикладів реалізації такого типу передачі енергії є інтерферон-γ, що має противірусну та імуностимулюючу дію. Інтерферон-γ містить один залишок Trp та чотири залишки Tyr. Спектр випромінювання димеру інтерферон-γ містить випромінювання як Tyr, так і Тrp при довжині хвилі збудження λзб=270 нм. При λзб=295 нм спостерігається лише випромінювання Trp [69].
Передача енергії в білках також може реалізуватися і від Phe до Tyr. Проте такий процес дуже рідко спостерігається через характерне для більшості протеїнів домінування випромінювання триптофану та тирозину. Передачу енергії таким шляхом спостерігали в неординарному білку HTa (гістон-подібний білок, що зв’язується з ДНК і міститься в хроматині), який містить 5 залишків Phe та один залишок Tyr і не містить Trp. Він має здатність внаслідок хімічних перетворень позбавлятися від залишку Tyr. Спектри випромінювання отримували при збудженні довжиною хвилі 252 нм. Порівняння спектрів збудження та випромінювання флюоресценції власне Tyr та білка показало, що у спектрах проявляється і Tyr і Phe, що підтверджує наявність передачі енергії збудження [70].