4. Клеточная инженерия. Тотипотентность растительных клеток.

1902 г. – Габерланд пытался вырастить изолированные листочки на растворе сахарозы. Но знаний было мало, неудачно. Выдвинул гипотезу о тотипотентности соматической раст. кл. (тотум – весь, потенция – сила) – способность сомат. кл. образовать целое раст. с теми же св-ми. Из кусочка можно получить целое растение (вегет. разм.).

Вещества получены искусственно (женьшеневый крем).

5. Клональное микроразмножение растений in vitro.

С давних пор существует вегет. способ размн. Клон (отпрыск, побег, черенок) – отпрыски растений размн. неполовым путем и они не являются индивидуумами, а лишь частью клона материнской особи и идентичны ей и между собой.

Преимущества: 1) Голландия (60 млн. раст. в год), Франция (40 млн.). Высокий коэф. размн. в год. 1 млн. раст. из одного (Лобанова). 2) Миниатюризация процесса, приводящая к уменьшению площади. 3) Возможность оздоровления от вирусных, миксоплазматических раст. и нематод. 4) В условиях in vitro можно размножать растения, которые вегет. не размн. (Гвинейская маслиничная пальма. Французы срезали приморий листьев (зачаточные), на пит. среде заставили образоваться растению).

6. Основные этапы клонального микроразмножения растений.

1) Выбор раст. донора. Взятие у него экспланта. Культивирование in vitro. Эксплантами м.б. любые части растения, но корни не берут. 2) Собственно микроразмн. 3) Укоренение стеблей, депонирование растений, растения содержат при низкой температуре на свету. 4) Высадка в грунт, теплицу, подращивание, реальзация.

7. Экспланты: происхождение, и их стерилизация.

Выбор зависит от времени года, фазы развития, органа, из которого взят. Эксплант – часть органа или ткани выращ. на пит. среде, или для получения каллуса. Каллус – ткань, возникшая путем неорганизованного деления клетки, без дифференциации. Для большинства раст. взятие экспланта лучше в фазу активного роста. Некоторые раст. лучше образуют побеги в фазу покоя (лилия). А тюльпан – в период сухого хранения.

Взятые экспланты стерилизуют: Обрабатывают мылом, в боксе раствором ядовитых в-в (NaClO - гипохлорат, CaClO2, 0,5-0,7% р-р, 15 мин.), препарат ртути 0,1% р-р., пероксидом. Промывают стерильной водой от яд. в-в. Осн. сложность введения в культуру асептика. Можно использовать для стериализации антибиотики (пенициллин). Эксплантами м.б. любые части растения, но корни не берут.

При оздоровлении берут только апек. меристему. Складывают в мешочки, промывают в проточной воде 2 часа. Затем в теплой, с добавлением детергента (ПАВ, ТВИН-20, мыло, шампунь). Далее стериализация в ламинарном боксе. Заливают в стер. стакане р-ми хим. в-в (сулема, диацид, пероксид) – 5-15 мин. Промывают стер. водой 3-5 раз в течении 10 мин. Мешочки достают, вершинки в петри. В мокрой капле, пинцетом, извлекают меристемы (0,1-0,3 мм.). На игле переносят на пит. среду. Ауксины доб. нельзя.

8. Питательные среды для клонального размножения, каллусообразования и морфогенеза in vitro.

in vitro выращивают на пит. средах. 1) Универсальная Мурасига-Скуга: агар (3,5 гр.), макросоли, CaCl2, микросоли, хелат железа, витамины (В1 – тиамин, В6 – пиридоксин, РР, аскорб. к-та, пантотеновая к-та, фолиевая к-та), глицин, набор а/к, ИУК, сахароза. 2) Среда Гамбурга. 3) Среда Бейца для определенных цветов.

В среды вводят минеральные соли с макро- и микроэлементами, витамины, а/к, сахара. Среды бывают жидкие и твердые. Агара 1-5%. Регулируют рН. Иногда вводят природные соединения: кокосовое молоко, гомогенизат банана.

Каусообразование вызывает большая доля ауксинов 24Д, 3,6 мг/л. среды.

Избавляются от сорняков. Из каллусной ткани получают стебли на среде ИУК, где цитокининов больше или равно 10/1. Для стимуляции вводят 0,1-2 мг. цитокининов. Соотношение цитокининов не приводит к делению клетки.