3.1.7 Исследование флавоноидов методом тонкослойной хроматографии
Принцип метода. На слой сорбента наносят образец объемом 1,0-5,0 мкл анализируемого раствора и погружают край пластинки в элюент, который находится на дне герметично закрываемой стеклянной камеры. Элюент продвигается по слою сорбента под действием капиллярных и гравитационных сил; анализируемая смесь перемещается в том же направлении. В результате многократного повторения актов сорбции и десорбции в соответствии с коэффициентом распределения в выбранной системе компоненты разделяются и располагаются на пластинке отдельными зонами.
После завершения процесса пластинку вынимают из камеры, высушивают и обнаруживают разделенные зоны по собственной окраске или после проявления их растворами реагентов, образующих окрашенные или флуоресцирующие пятна с компонентами разделяемой смеси. Полученная картина распределения хрома-тографических зон называется хроматограммой (рисунок 3.3).
Количество компонента в хроматографической зоне определяют непосредственно на слое сорбента по площади зоны (обычно ее диаметр варьирует от 3 до 10 мм) или интенсивности ее окраски. Используют также автоматические сканирующие приборы, измеряющие поглощение, пропускание или отражение света, либо радиоактивность хроматографических зон. Разделенные зоны можно соскоблить с пластинки вместе со слоем сорбента, экстрагировать компонент в растворитель и анализировать раствор подходящим методом (спектрофотометрия, люминесцентный, атомно-абсорбционный, атомно-флуоресцентный, радиометри-ческий анализ, масс-спектрометрия и т.д.). Погрешность количественного определения обычно составляет 5-10 %; пределы обнаружения веществ в зонах – 10-3-10-2 мкг (по окрашенным производным) и 10-10-10-9 мкг (с применением люминесцентного анализа).
Рисунок 3.3 – Хроматограмма, полученная при разделении смеси трех компонентов методом тонкослойной хроматографии
Ход работы. Хроматографирование флавоноидов осуществляли на пластинках типа 25 TLC aluminium sheets (Mercx, Германия), СТХ-1А (Sorbfil, ЗАО Сорбполимер, г. Краснодар) в системах растворителей изопропиловый спирт – уксусная кислота – вода (2,0 : 0,5 : 2,5), н-бутанол – уксусная кислота – вода (2,6 : 1,4 : 0,3) соответственно.
На слой сорбента наносили пробу, объемом 5,0 мкл анализируемых настоек. После окончания процесса на хроматограммах флавоноиды обнаруживали по наличию свечения в УФ-свете при длине волны 365 нм до и после обработки хроматограмм 5 % спиртовым раствором алюминия хлорида [33].
3.1.8 Спектрофотометрическое исследование фракций флавоноидов
Принцип метода. Спектрофотометрия – метод исследования и анализа веществ, основанный на измерении спектров поглощения в оптической области электромагнитного излучения. По типам изучаемых систем спектрофотометрию обычно делят на молекулярную и атомную. Различают спектрофотометрию в ИК, видимой и УФ областях спектра. Спектрофотометрическое исследование фракций флавоноидов осуществляется в видимой области спектра. Основано на поглощении электромагнитного излучения соединениями, содержащими хромофорные (С=С, С=О) и ауксохромные (ОН, NH2 и другие) группы.
Ход работы. На спектрофотометре SPECORD 200 plus (Analitikjena, Германия) записывали спектры фракций флавоноидов, полученных с помощью гель-хроматографии, в диапазоне длин волн от 200 до 900 нм. Добавляли во фракции 5 % раствор алюминия хлорида. После чего записывали новые значения спектров.