Введение в генную инженерию

Технология рекомбинантных ДНК (молекулярное клонирование, генная инженерия) – это совокупность экспериментальных процедур, позволяющая осуществить перенос генетического материала из одного организма в другой.

Схема молекулярного клонирования:

1. Из организма донора нужных генов экстрагируют нативную ДНК (чужеродную ДНК), подвергают ее ферментативному гидролизу (то есть разрезают), и соединяют (лигируют) с другой ДНК, представляющую собой вектор для клонирования, с образованием новой, рекомбинантной молекулы (СЛАЙД 67).

2. Эту конструкцию вводят в клетку-хозяин, где она реплицируется и передается потомкам. Этот процесс называется трансформацией.

3. Идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК, то есть трансформированные клетки.

4. Получают специфический белковый продукт, синтезированных клетками-хозяивами, что служит подтверждением клонирования искомого гена.

Молекулярное клонирование стало возможным только после выделения высокоспецифичных бактериальных ферментов, которые узнают определенные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и расщепляют обе цепи. Такие ферменты называют эндонуклеазы рестрикции, или рестриктазы.

Рестриктазы I класса.

Расщепляют ДНК в произвольных местах на расстоянии от нескольких сот до нескольких тысяч пар нуклеотидов от сайтов узнавания, получая при этом сплошной спектр рестриктов. Поэтому эти рестриктазы в генетической инженерии практически не используются, так как с их помощью нельзя получить фрагменты ДНК, строго детерминированные по размерам и содержанию информации.

Рестриктазы II класса.

У рестриктаз II класса сайты расщепления совпадают с сайтами узнавания или находятся рядом с ними на строго определенном расстоянии, что позволяет получать рестрикты определенной длины. Расщепляя двунитевую ДНК, они образуют, как правило, 5΄ P и 3΄ ОН концы. По структуре узнавания и способу расщепления ДНК рестриктазы делятся на несколько подклассов.

Классификация рестриктаз II типа по способу узнавания ДНК

Более половины всех рестриктаз относятся к подклассу IIP (СЛАЙД 68), которые узнают тетра, гекса и октануклеотидные последовательности с вращательной симметрией второго порядка (подобные структуры называются палиндромами). Рестриктазы этого класса действуют либо на определенные сайты, либо на сайты, в которых присутствуют альтернативные основания, занимающие симметричные позиции.

Рестриктазы подкласса IIW узнают пента и гептануклеотидные палиндромы, в центре которых находится один из двух альтернативных нуклеотидов или любой нуклеотид. Фланкирующие нуклеотиды, стоящие в симметричных положениях, также могут быть альтернативными.

Рестриктазы подкласса IIN узнают палиндромы, прерываемые несколькими произвольными нуклеотидами.

Рестриктазы подкласса IIS и IIT узнают непалиндромные последовательности, состоящие из 4-6 и более пар нуклеотидов. Подклассы отличаются тем, что в первом случае рестриктазы расщепляют ДНК на определенном расстоянии от сайта узнавания, а во втором случае – в самом сайте.

Классификация рестриктаз по способу расщепления ДНК.

По способу расщепления ДНК рестиклазы II класса распадаются на два типа. Одни осуществляют ступенчатый разрез нитей ДНК, то есть положения гидролируемых связей на разных нитях не совпадают (СЛАЙД 69). Другие осуществляют прямой разрез нитей ДНК, то есть расщепляются совпадающие связи (СЛАЙД 70). В результате у фрагментов ДНК образуются, соответственно, выступающие однонитевые или ровные (тупые) концы. В местах разрезов выступающие последовательности нуклеотидов, относящиеся к разным нитям ДНК, являются комплементарными, или липкими. В случае действия рестриктаз подкласса IIP, узнающих палиндромные сайты, все рестрикты обладают липкими концами. Выступать могут как 5΄, так и 3΄концы.

Многие рестриктазы, относящиеся к разным семействам, узнают на ДНК одинаковые сайты. Такие рестриктазы называют изомерами. Они подразделяются на изошизомеры и гетерошизомеры. Первые не только узнают одинаковые сайты, но и одинаково их расщепляют, а вторые эти сайты расщепляют по-разному. Рестрикты, имеющие одинаковые липкие концы благодаря действию одной и той же рестриктазы или ее изошизомеров, способны объединяться друг с другом с восстановлением сайта рестрикции между ними. Также, одинаковые липкие концы могут образовываться при действии на ДНК рестриктаз, узнающих различные сайты.

Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ).

Присутствие в геноме полиморфных сайтов рестрикции обуславливает вариацию длины рестрикционных фрагментов. В геноме человека такие полиморфные сайты рестрикции встречаются во всех хромосомах с частотой приблизительно 1:300 – 500 пар нуклеотидов.

Этот метод используется для предварительного уточнения локализации мутации при наличии в амплифицированном фрагменте известных сайтов рестрикции и для выявления уже известных точковых замен, меняющих сайт узнавания рестриктаз. Для этого продукты амплификации разрезают соответствующей рестриктазой и на электрофореграмме сравнивают длину изучаемых рестрикционных фрагментов с контролем.