Секвенирование.

Секвенирование ДНК – это процесс определение ее нуклеотидной последовательности.

Наиболее широко используемый метод для ДНК-анализа – секвенирование по Сэнгеру. Метод секвенирования Сэнгера основан на свойстве химических аналогов четырех нуклеотидов, известных как дидезоксинуклеотиды (ddA, ddC, ddG, ddT), не имеющие 3΄ гидроксильной группы в дизоксирибозе. У таких нуклеотидов имеется 2΄ гидроксильная группа, в норме отсутствующая в ДНК. Включаясь в растущую нить ДНК, дидезоксинуклеотиды не позволяют ДНК полимеразе присоединять следующее основание и, следовательно, продолжать рост цепи ДНК (СЛАЙД 43).

1. Проводят амплификацию необходимого фрагмента ДНК, используя обычную ПЦР

2. Реакция Сенгера – модифицированная ПЦР, где используются четыре нормальными нуклеотидами и их дидезокси-аналоги. Каждый дидезокси-аналог помечают определенным флуоресцентным красителем со своим спектром излучения. Полимераза включает или нормальный нуклеотид и продолжает синтез нити, или дидезоксинуклеотид, при этом завершая синтез.

3. Разорванные нити разделяют электрофорезом (полиакриламидный или капиллярный), а конкретный дидезоксинуклеотид, вызвавший остановку синтеза, выявляют по цвету флуоресценции включенной метки.

В настоящее время широкое применение получили капиллярные секвенаторы по Сэнгеру фирмы Applied Biosystems (СЛАЙД 44).

К секвенированию второго поколения относят главным образом три платформы:

• Roche/454 FLX Pyrosequencer (Roche Applied Sciences)

• Illumina Genome Analyzer (Illumina)

• SOLiD (Applied Biosystems)

Пиросеквенирование на платформе Roche/454

1. ДНК, случайным образом фрагментируется на кусочки по 300–500 пар оснований. Затем комплементарные цепи фрагмента разделяются, к каждой цепи фрагментов пришивается одинаковый для всех олигонуклеотид-«адаптер», который позволяет отдельным цепям налипать на пластиковые бусинки. Последовательность этого олигонуклеотида позволяет позднее в процессе секвенирования распознавать ДНК-матрицу (СЛАЙД 46).

2. Смесь разъединённых на комплементарные цепи фрагментов разбавляют таким образом, что каждая бусинка получает лишь по одной индивидуальной цепи. Каждая бусинка оказывается заключённой в капельку, окруженную маслом и содержащую смесь для осуществления полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая и проходит отдельно в каждой капельке эмульсии. Это так называемая эмульсионная ПЦР (СЛАЙД 47).

3. Далее эмульсия разрушается, вновь двуцепочечные фрагменты ДНК (образовавшиеся в ходе ПЦР) разделяются, и бусинки, несущие одноцепочечные копии ДНК-матрицы, помещаются в лунки «предметного стекла» — слайда особой конструкции. Каждая лунка такого слайда образует отдельный пиколитровый «реактор», в котором и будет происходить реакция секвенирования (СЛАЙД 48).

4. Помимо ДНК-матрицы, в каждую лунку добавляют ферменты, необходимыми для пирофосфатного секвенирования. Нуклеотиды (одного вида за раз) и другие реактивы, необходимые для реакции секвенирования, подаются последовательно в проточную камеру, куда помещается слайд. Каждый раз, когда определённый нуклеотид встраивается в растущую цепь ДНК в какой-нибудь из лунок, в ней высвобождается молекула пирофосфата, которая, в свою очередь, является необходимым предшественником компонента другой ферментативной реакции. Её катализирует особый фермент, люцифераза светлячка. Но для её осуществления необходим АТФ. Новообразованный пирофосфат превращается в лунке в АТФ под действием ещё одного фермента — АТФ-сульфурилазы. И тогда люцифераза окисляет люциферин до оксилюциферина, а эта реакция сопровождается хемилюминесценцией — маленькой вспышкой света. Дно слайда находится в оптическом контакте с оптико-волоконным световодом, подключённым к прибору с зарядовой связью. Это позволяет регистрировать излучаемые фотоны со дна каждой индивидуальной лунки, в которой произошло встраивание известного нуклеотида (СЛАЙД 49).

Кластерное секвенирование на платформе Illumina.

1. Сначала создается библиотека фрагментов ДНК из секвенируемого генома. ДНК с помощью ультразвука или специального фермента расщепляется на произвольные фрагменты длиной в несколько сотен нуклеотидов, из которых выбираются обладающие заданной длиной. После этого к ним с двух концов ковалентно присоединяются различные адаптерные последовательности (СЛАЙД 50).

2. Этот раствор поступает на специальный микрочип с иммобилизованными фрагментами ДНК, комплементарными адаптерным последовательностям, — праймерами. Участки геномной ДНК прикрепляются с помощью адаптерных последовательностей к молекулам ДНК на чипе. С помощью ДНК-полимеразы у всех таких фрагментов достраивается вторая комплементарная цепь, которая будет уже ковалентно связана с праймером. Она случайно изгибается, и в какой-то момент попадет на праймер, комплементарный ее адаптерной последовательности. Они свяжутся, и снова достроится вторая цепь. Это повторяют несколько раз, после чего один из типов праймеров отрезают от молекулы ДНК, чтобы в образовавшемся кластере остались только одинаковые цепи. Всего на чипе образуются сотни миллионов таких кластеров (СЛАЙД 51).

3. К кластерам добавляют праймеры, комплементарные одной из адаптерных последовательностей, с которой они связываются. Затем добавляют ДНК-полимеразу и специально модифицированные нуклеотиды с прикрепленным к ним флуорофором (разным у разных типов нуклеотидов), синтез после которых заблокирован. Они присоединяются к молекулам ДНК в соответствии с правилом комплементарности. Затем камера сканирует, какой флуорофор появился в каждом кластере по цвету свечения в лазере, и компьютер запоминает расположение кластеров (СЛАЙД 52). Таким образом определяется, какой нуклеотид встроился в цепь. После этого отщепляются флуорофоры от всех нуклеотидов, и дальнейший синтез цепи разблокируется. Все повторяется снова: добавляются нуклеотиды, чип сканируется, чтобы определить, какой нуклеотид присоединился к какому кластеру и так далее (СЛАЙД 53).

Лигазное секвенирование на платформе Solid

Подобно другим технологиям секвенирования второго поколения на платформе Solid используются адапторные последовательности, лигированные к фрагментам ДНК при создании библиотеки, а также эмульсионная ПЦР с маленькими магнитными частицами. Коренным отличием от остальных платформ является использование ДНК лигазы и оригинального подхода к секвенированию амплифицированных фрагментов, основанного на динуклеотидном кодировании.

1. После приготовления библиотеки и эПЦР ДНК матрицы подвергаются модификации с 3' конца, чтобы они смогли ковалентно присоединиться к слайду (СЛАЙД 54).

2. Присоединение универсального праймера к адаптерной последовательности.

3. Добавление лигазы и зондов, меченных специфическим флуорофором, в зависимости от наличия в последовательности зонда соответствующих первых двух нуклеотидов (СЛАЙД 55).

4. Удаление концевой части зонда с формированием 5΄ ОН свободного конца

5. Повторение циклов лигирования, детекции и расщепления, благодаря чему происходит наращивание последовательности.

6. После серий лигирования к последовательности первого праймера, получившуюся цепь денатурируют от ДНК матрицы и добавляют следующий праймер, смещенный на один нуклеотид в 3΄ сторону. Затем циклы повторяются (СЛАЙД 56).

7. Пять раундов удлинения праймеров совершаются для каждой нуклеотидной последовательности. В ходе этого процесса, практически каждый нуклеотид распознается в двух независимых реакциях лигирования с двух различных праймеров.

8. Полученное свечение флуорофоров декодируется в нуклеотидную последовательность на основании того, кто каждый нуклеотид перекрывается (СЛАЙД 57, 58).

Секвенирование третьего поколения (Next-Next Generation Sequencing) имеет совершенно иной механизм считывания нуклеотидной последовательности.

Полупроводниковое секвенирование на платформе Ion Torrent (СЛАЙД 60).

Подобно другим методам, создание библиотеки включает фрагментацию ДНК, пришивание адаптерных последовательностей и эПЦР. Однако, полупроводниковое секвенирование основано на регистрации изменения pH при включении нуклеотида в растущую нить ДНК. Выделяющиеся в этой реакции протоны изменяют поверхностный заряд покрывающего сенсорный чип pH чувствительного слоя, что влияет на проводимость расположенной ниже сенсорной зоны (СЛАЙД 61).

В настоящее время существует три варианта чипов для полупроводникового секвенирования: 314 микрочип (1,2 млн. сенсоров), от 10 мегабаз (млн. пар нуклеотидных остатков); 316 микрочип (6,3 млн. сенсоров), от 100 мегабаз; 318 микрочип (12 млн. сенсоров), от 1 Гб (млрд. пар нуклеотидных остатков) качественно прочитанной ДНК (СЛАЙД 63, 64).

Секвенирование с помощью нанопор (СЛАЙД 65)

Отрицательно заряженная одноцепочечная ДНК проходит через нанометровую пору в мембране, наружная поверхность которой несёт отрицательный заряд, а внутренняя — положительный. Как только очередной нуклеотид перекрывает внутреннее отверстие в поре, электропроводность мембраны изменяется. Нуклеотиды разного типа, из которых состоит цепочка ДНК, немного различаются по размерам и поэтому закрывают пору в большей или меньшей степени и на разное время (СЛАЙД 66). Соответственно этому изменяется и электропроводность. Если удастся существенно повысить разрешающую способность метода, то каждый скачок электропроводности будет отвечать прохождению через пору одного нуклеотида, и с диаграммы, получаемой на выходе, можно будет считывать нуклеотидные последовательности.