6.4.2 Клонирование в дрожжах

Среди дрожжей наиболее изучены S.serevisiae. Дрожжевая плазмида Scp1 содержит около 6300 пар оснований и имеет от 50 до 100 копий на клетку. Ее гибриды с плазмидами обычно используют в качестве векторов. Работа с дрожжами облегчается тем, что они могут расти в жидкой среде и давать колонии на твердой среде, имеют короткое время регенерации.

Процедура внедрения ДНК в клетки дрожжей достаточно проста. Целлюлозную стенку удаляют обработкой ферментами, получая сферопласты. Их инкубируют с ДНК в присутствии хлорида кальция и полиэтиленгликоля. Мембрана при этом становится проницаемой для ДНК. Дальнейшая инкубация сферопластов на твердой среде восстанавливает клеточную стенку. Последующая селекция заключается в выращивании клонов на среде, в которой отсутствует тот или иной компонент. При этом трансформаты легко отбираются. Применяя приемы, аналогичные использовавшимся при клонировании бактерий, удается достичь синтеза чужеродных белков в клетках дрожжей, например, интерферона человека.

6.4.3 Клонирование в клетках животных

В целях исследования функционирования генов высших эукариот занимаются проблемой введения генов в клетки млекопитающих. Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями.

Например, метод маркера. Метод служит для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК. Пример: предварительно получали рекомбинантную плазмиду E.coli с геном тимидинкиназы из вируса герпеса. Затем с помощью полученной плазмиды трансформировали животные клетки, дефектные по синтезу тимидинкиназы, после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде.

Также сконструировано большое количество челночных векторов, способных к репликации в животной и бактериальной клетках.

Разработана технология микроинъекции ДНК непосредственно в ядро клетки. Трансформация соматических клеток млекопитающих дает возможность изучать механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки животных, в том числе человека. Культуры клеток млекопитающих могут быть эффективным источником выделения ряда вирусных антигенов с целью получения вакцин для человека и животных.

В настоящее время разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки млекопитающих, мух и некоторых растений с целью изменения свойств организмов, таких как скорость роста, устойчивость к заболеваниям и внешним воздействиям. Такие работы были начаты на крупных яйцах амфибий, теперь продолжены с яйцеклетками и эмбрионами мышей.

Микроинъекцию клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приёмной матери или дают развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку. Таким образом были инъецированы гены интерферона и инсулина человека, ген глобулина кролика, ген тимидинкиназного вируса герпеса. Выживает от 10 до 30 % яйцеклеток, доля трансгенных мышей составляет от нескольких до 40 %.

До сих пор не удается встроить чужеродную ДНК в заданный участок хромосомы, вытеснить ген и заменить его другим. Исследования проводятся с целью лечения генетических заболеваний.