5.2 Выбор штамма и условий культивирования

Целесообразность применения микроорганизмов для производства ферментов заключается в следующем:

1) генетическими манипуляциями удаётся в тысячу и более раз увеличить уровень катаболитных и в несколько сот раз уровень биосинтетических ферментов;

2) энергетически оправдано выращивание микробных клеток в больших масштабах в связи с применением недорогих сред и быстрого роста микроорганизмов;

3) огромное разнообразие реакций, к которым способны микроорганизмы. Это особенно касается вторичного метаболизма;

4) микроорганизмы служат источником не только таких ферментов, которые встречаются у животных и растений, но и ряда уникальных ферментов, нигде более не обнаруженных. Например, целлюлоза, танназа, гидрогеназа и др. Среди микроорганизмов есть виды, развивающиеся при экстремально высоких температурах (87 ºС), в связи с чем потенциально возможно создание термостабильных штаммов;

5) способность микроорганизмов адаптироваться к различным окружающим условиям, что позволяет переносить культуру на производство, где она растет на дешевых субстратах.

Промышленное производство и применение ферментов основано на двух важных факторах: во-первых, ферменты образуются в живых клетках; во-вторых, они могут проявлять свое специфическое действие в среде независимо от живых клеток.

При первоначальном выделении штамма исходят из того, что микроорганизмы адаптируются к утилизации субстрата, находящегося в изобилии в местах их обитания, и, следовательно, образуют ферменты, реагирующие с этим субстратом.

Поэтому продуценты целлюлаз и лигнолитических ферментов выделяются из лесных почв, продуценты пектиназ – из фруктов и растений, деструкторы мочевой кислоты – из птичьего загона и т.д.

Ферменты близкородственных штаммов имеют сходные свойства, а у дальнеродственных – могут сильно отличаться. Первая ступень производства ферментов состоит в селекции организма, образующего желаемый фермент в наибольшем количестве. При этом учитывают следующие общие требования к продуценту:

1) желательно образование внеклеточных ферментов, так как их легче выделить;

2) высокий выход фермента за короткое время;

3) очистка фермента от культуральной жидкости должна быть легкой;

4) штаммы не должны продуцировать антибиотики, токсичные вещества и не должны быть родственниками штаммов, образующих токсины.

Чтобы вызвать сверхсинтез ферментов используют ряд методов, связанных с изменением окружающих условий роста и ведущих к изменению генетики организма.

5.3 Технология культивирования микроорганизмов – продуцентов ферментов и выделение ферментов

Технологический процесс можно разбить на три стадии:

1) получение посевного материала;

2) получение производственной культуры методами поверхностного или глубинного культивирования;

3) выделение из готовой производственной культуры технических или очищенных ферментных препаратов.

Поверхностный метод состоит в культивировании микроорганизмов на поверхности увлажненных стерилизованных отрубей, размещенных в кюветах. Инкубацию ведут в специальном термостатируемом цехе при постоянном контроле в нем температуры, влажности и подачи воздуха.

Глубинный метод более экономичен. Для его реализации применяются ферментеры из нержавеющей стали, снабженные устройствами для перемешивания и подачи в жидкую питательную среду стерильного воздуха.

Наиболее прогрессивен проточный метод, который обеспечивает непрерывную подачу в ферментер питательной среды и посевного материала и непрерывный отбор продуктов жизнедеятельности и микробиальной массы. Достоинством метода является возможность длительное время поддерживать в автоматическом режиме рост культуры микроорганизмов (до 200 суток).

Выделение и очистка фермента из культуры микроорганизмов – достаточно трудоемкая и дорогостоящая процедура, поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищенного препарата, его не очищают. В промышленности широко используют коммерческие препараты, чистота которых составляет всего 0,1 % (то есть 99,9 % составляют примеси). К таким отраслям относят спиртовую, кожевенную, текстильную промышленность, сельское хозяйство, производство бытовой химии.

Неочищенные препараты получают в мягком режиме высушивания культуры микроорганизмов вместе с остатками питательной среды. Такие препараты получают или из экстракта культуры продуцента, выращенного поверхностным способом, или из фильтрата культурной жидкости продуцента, выращенного глубинным способом.

Для большинства отраслей пищевой промышленности, научных исследований и медицины требуются очищенные ферментные препараты. Источником выделения фермента может быть биомасса микроорганизмов, экстракт или фильтрат культуральной жидкости. Биомассу микроорганизмов необходимо тщательно измельчить, вплоть до разрушения субклеточных структур: лисозом, митохондрий, ядер и т.д.

Затем препараты очищают осаждением органическими растворителями, солями, после чего диализом, аффинной хроматографией, переосаждением, гель-фильтрацией, сорбцией, кристаллизацией и пр.

Так как ферменты имеют белковую природу, то особое значение придают соблюдению режимов, сохраняющих их активность при инактивации сопутствующих балластных белков. Очищенные ферменты хранят при низкой температуре (до минус 80 ºС). Для стабилизации ферментов в их препараты добавляют коферменты и субстраты.