3.2. Распределительная хроматография
Данный вариант хроматографии основан на распределении веществ между двумя несмешивающимися жидкостями. Удерживание, а, следовательно, и разделение в распределительной хроматографии основано главным образом на различной растворимости компонентов в жидкой подвижной и неподвижной фазе, которая зависит от полярности компонентов и полярности фаз. Так, чем выше растворимость разделяемых веществ в неподвижной фазе, тем больше времена их удерживания. Напротив, если растворимость веществ больше в подвижной фазе, то их времена удерживания могут быть близки к времени удерживания неудерживаемого компонента.
Неподвижные фазы
В распределительной хроматографии неподвижной фазой служит жидкость, которая может быть иммобилизирована на поверхности носителя либо химически закреплена на ней.
Иммобилизированные жидкости удерживаются на носителе только за счет физической адсорбции. В качестве носителей обычно используют силикагель либо оксид алюминия. В нормально-фазовой хроматографии в качестве неподвижной фазы используют полярные жидкости – воду, триэтиленгликоль. В случае обращено-фазовой хроматографии неподвижная фаза является малополярной жидкостью, например, каким-либо углеводородом. Из-за непрочной связи с носителем жидкости иммобилизированные на носителе используются в качестве неподвижных фаз только в классическом варианте жидкостной хроматографии. При высоких давлениях, используемых в ВЭЖХ, практически всегда происходит вымывание неподвижной фазы. Кроме того, при использовании иммобилизированных жидкостей невозможно градиентное элюирование.
Химически закрепленные жидкости получают химической модификацией поверхности носителя, в качестве которого обычно выступают силикагель, оксид алюминия или полимерные ионообменники. В качестве химически привитых фаз в нормально-фазовой хроматографии используют полярные функциональные группы, например, диол, аминогруппу и др. В случае обращенно-фазовой хроматографии для модифицирования поверхности носителя наиболее широко применяют алкильные группы: С18 (н-октадецил), С8 (н-октил) и др.
Подвижные фазы
В обращено-фазовой хроматографии имеют дело с полярными подвижными фазами на основе таких растворителей как метанол, ацетонитрил, ТГФ, вода, или, еще чаще смеси воды с органическими растворителями, которые в этом случае называют модификаторами. Для достижения необходимой полярности изменяют соотношение вода/органический растворитель. Метанол обычно служит для разделения кислотных соединений, а ацетонитрил – для основных соединений. ТГФ используют для разделения соединений с большим дипольным моментом. Эти растворители прозрачны в УФ области и обладают низкой вязкостью.
В нормально-фазовой хроматографии основными компонентами подвижной фазы могут быть диэтиловый эфир, дихлорметан, хлороформ. Элюирующую силу можно регулировать с помощью н-гексана.
Оптимизация процесса разделения
Выбор подвижной фазы. В отличие от газовой хроматографии, где для достижения приемлемого разделения газ-носитель оставляют одним и тем же, а варьируют полярность неподвижной фазы, в жидкостной хроматографии, как правило, изменяют полярность, и как следствие, элюирующую силу подвижной фазы. Это гораздо легче сделать, чем менять колонки. Поэтому выбор подвижной фазы является важной частью разработки методик разделения в жидкостной хроматографии.
В большинстве случаев при использовании чистого растворителя нельзя добиться эффективного разделения соединений. В этом случае переходят к смесям двух или нескольких растворителей. Так, если обозначить растворитель с меньшей элюирующей силой А, а с большей – В, то для достижения эффективного разделения надо экспериментально подобрать оптимальное содержание В в смеси. Прежде всего, нас интересуют два фактора оптимизации разделения: фактор удерживания k, т.е. параметр полярности, и фактор разделения α, т.е. коэффициент селективности. Мы будем подбирать растворители с такой элюирующей силой, чтобы все значения k для всех элюируемых веществ попадали в диапазон от 1 до 20. Однако, добиваясь приемлемого удерживания, нельзя забывать о том, что разделение большинства хроматографических пиков должно быть как можно более полным (по возможности до базовой линии). Например, если мы добились неполного разделения пиков при содержании растворителя В 35%, то изменив его содержание до 40 или 45%, удается получить лучшее разделение хроматографических зон веществ и, следовательно, улучшить разрешение. Однако, в свою очередь, это может привести к более значительному перекрыванию зон других компонентов.
В качестве примера рассмотрим процесс оптимизации хроматографического разделения смеси веществ при использовании в качестве подвижной фазы смесей ACN/H2O, MeOH/H2O и ACN/MeOH/H2O. Пусть при использовании в качестве ПФ смеси, состоящей из 80% ACN и 20% H2O, разделение соединений происходит за приемлемое время (факторы удерживания попадают в требуемый диапазон), однако факторы удерживания соединений имеют близкие значения, следовательно, разделение при этом далеко не полное. При уменьшении содержания ACN до 40% факторы удерживания увеличиваются, но разделение некоторых компонентов все еще неполное. Переход от ACN к 50% МеОН позволил полностью разделить неразделенные ранее компоненты, но при этом зоны других веществ начинают перекрываться. Наконец, при использовании смеси двух растворителей (смесь 1:1 применяемых ранее 40% ACN и 50% MeOH) достигается некоторое усредненное разделение при допустимом разрешении пиков.
Предложенный эмпирический подход при выборе состава подвижной фазы работает в большинстве случаев.
Градиентное элюирование. Градиентное элюирование в ЖХ является наиболее эффективным путем разделения аналитов с достаточно различающимися временами удерживания. При изократическом элюировании часто наблюдается недостаточное разрешение пиков слабоудерживаемых веществ либо, в случае длительного удерживания компонентов, уширение хроматографических зон.
Практическое применение
Распределительная хроматография находит применение практически во всех областях, так или иначе связанных с определением органических веществ: в фармацевтике, биохимии, токсикологии, медицине, различных отраслях промышленности. Обычно методом распределительной жидкостной хроматографии определяют незаряженные вещества с молярной массой до 3000.
Наибольшее распространение получил обращенно-фазовый вариант распределительной хроматографии, на долю которого приходится около 70% всех хроматографических анализов. Его используют для определения широкого круга веществ различной полярности от сильнополярных до малополярных. Обращенно-фазовую хроматографию применяют для анализа продуктов питания, лекарственных средств, загрязнителей окружающей среды. Ее возможности существенно расширяются при использовании метода ион-парной хроматографии, который позволяет определять ионизированные вещества. Последние, как правило, плохо удерживаются неполярной поверхностью силикагеля, содержащей связанные алкильные группы, из-за высокой растворимости в полярной подвижной фазе, быстро элюируются и поэтому плохо разделяются. Для увеличения взаимодействий ионогенных соединений с неподвижной фазой в состав элюента вводят небольшие количества (10-3 – 10-2 М) вещества, называемого ион-парным реагентом. В качестве ион-парных реагентов при разделении катионов обычно используют алкилсульфаты или алкилсульфонаты, а при разделении анионов – ионы тетраалкиламмония.
Принято считать, что разделение и удерживание веществ в ион-парной хроматографии обусловлено двумя механизмами:
Ион-парный реагент сорбируется на неподвижной фазе за счет неспецифических взаимодействий, превращая ее в ионообменник, который в зависимости от природы ион-парного реагента можно рассматривать как катионо- или анионообменник. В качестве примера на рисунке 8 показана жидкостная хроматограмма этанольного извлечения из корня барбариса, содержащая смесь алкалоидов, протобербериновой группы (пик, отмеченный значком *, соответствует берберину), полученная с помощью микроколоночного жидкостного хроматографа «Миллихром-4». Колонка длиной 64 мм и диаметром 2 мм. Неподвижная фаза – Separon SGX C18 (диаметр частиц сорбента 5 мкм). Подвижная фаза – смесь ацетонитрила и водного 510-2 М KH2PO4 (40:60) c добавлением 210-3 М додецилсульфата натрия. Детектор – спектрофотометрический (260 нм).
Рис. 8 Хроматограмма этанольного извлечения из корня барбариса
Ион-парный реагент образует с разделяемыми соединениями ионную пару в растворе, которая затем сорбируется на неподвижной фазе. Примером может служить разделение ароматических кислот HAr. В подвижную фазу, состоящую на 95% из воды и 5% изопропанола, вводят 2·10-3 М хлорида тетрабутиламмония Bu4N+Cl-. Это приводит к образованию ионных пар в подвижной фазе: Bu4N+ + HAr = [Bu4N+Ar-] + H+. Эти пары значительно лучше удерживаются поверхностью силикагеля.
Нормально-фазовую распределительную хроматографию используют для определения малополярных и неполярных веществ. Основными областями ее применения является разделение алкилпроизводных полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), многие из которых обладают канцерогенными и мутагенными свойствами и являются опасными загрязнителями воздуха, воды, почвы; а также групповое разделение алканов, липидов, стероидов и жирорастворимых витаминов.