4. Практическое применение вэжх

Высокоэффективная жидкостная хроматография используется для разделения, в том числе и препаративного выделения, обнаружения и идентификации, а также количественного определения веществ различной химической природы (как полярных, так и неполярных, как ионов, так и молекул, как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных).

В фармацевтическом анализе метод ВЭЖХ используется значительно чаще, чем метод газовой хроматографии. Это объясняется тем, что многие лекарственные вещества представляют собой сложные органические соединения, которые являются термолабильными (разрушаются при нагревании) или имеют низкую летучесть (характеризуются высокими температурами кипения). По чувствительности и селективности во многих случаях метод ВЭЖХ не уступает, а порой и превосходит методы газовой хроматографии. Основные области применения ВЭЖХ в фармацевтическом анализе:

• идентификация лекарственных веществ, присутствующих в лекарственных формах;

• определение примесей в лекарственных веществах (как в индивидуальных образцах, так и в лекарственных формах);

• количественное определение лекарственных веществ, входящих в состав лекарственных форм (особенно в случае лекарственных форм сложного состава или при малом содержании определяемого компонента);

• определение лекарственных веществ в биологических объектах.

В настоящее время разработаны методики идентификации и количественного определения методом ВЭЖХ практически всех групп фармацевтических препаратов. Детектирование в большинстве случаев проводится с помощью фотометрических детекторов. Так, примерно 80% фармакопейных статей на лекарственные препараты включают для анализа именно этот метод.

5. Плоскостная хроматография

Методы плоскостной хроматографии основаны на различии скоростей перемещения компонентов анализируемой смеси в плоском слое сорбента при движении растворителя (элюента).

Различают бумажный и тонкослойный варианты плоскостной хроматографии.

Как в БХ, так и в ТСХ разделение может быть обусловлено раз­личными механизмами, например, адсорбционным, распределитель­ным, ионообменным, ион-парным и др.

Бумажная хроматография имеет ряд существенных недостатков и поэтому в настоящее время используется сравнительно редко:

• процесс разделения зависит от состава и свойств бумаги;

• содержание воды в порах бумаги может изменяться в зависимости от условий хранения;

• очень низкая скорость хроматографирования (процесс получения хроматограммы может занимать нескольких суток);

• низкая воспроизводимость результатов.

5.1. Тонкослойная хроматография

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), получивший в настоящее время широкое применение, был разработан Н. А. Измайловым и М. С. Шрайбер еще в 1938 г.

5.1.1. Неподвижные и подвижные фазы

Хроматографическая пластинка представляет собой тонкую плоскую подложку, изготовленную из алюминиевой фольги, стекла или полимера (обычно полиэтиленгликольтерефталата), с нанесенным на нее вручную или промышленным способом сорбентом (неподвижной фазой). Для придания стабильности слоя сорбента на подложке используют различные связывающие вещества (гипс, крахмал, силиказоль, полиакриламид).

Важной характеристикой сорбентов является диаметр их частиц. В классическом варианте ТСХ для производства пластинок используются частицы диаметром 11 – 20 мкм. В высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) используют сорбенты, диаметр частиц которых составляет 5 – 7 мкм. Сравнительная характеристика пластинок для ТСХ и ВЭТСХ приведена в таблице 6.

Таблица 6	Некоторые характеристики пластинок для ТСХ и ВЭТСХ
Характеристики		ТСХ	ВЭТСХ
Средний размер частиц, мкм		11 – 20	5 – 7
Толщина слоя, мкм		250	100
Длина пробега фронта растворителя, см		10 – 15	3 – 5
Количество растворителя, мл		50	5 – 10
Предел детектирования, мкг		1	0.1
Диаметр пятна, мм		2 – 4	1

Разделение на пластинах для ВЭТСХ получается более отчетливое и осуществляется за меньший промежуток времени. Недостатком таких пластин является значительно меньшая нагрузочная емкость.

В качестве неподвижной фазы в методе ТСХ наиболее часто используют силикагель и его химически модифицированные производные: С₁₈, -NH₂, -CN и др. (аналогично ВЭЖХ), оксид алюминия, флорисил. Для ионообменного варианта тонкослойной хроматографии применяют пластинки на полимерной подложке, которые покрыты катионо- или анионообменными смолами.

Особое место среди неподвижных фаз занимают импрегнированные различными веществами силикагели. Импрегнирование обычно проводят путем опрыскивания или погружения в раствор выбранного реагента, в качестве которых широко используются катионы различных металлов, борная кислота и др. В процессе хроматографического разделения эти соединения образуют различные по устойчивости комплексы с компонентами разделяемой смеси, что в сою очередь приводит к эффективности разделения.

Для детектирования веществ, поглощающих в УФ области спектра, часто добавляют флуоресцентный индикатор (люминофор).

В качестве подвижной фазы в методе ТСХ применяют либо индивидуальные растворители, либо их смеси, взятые в определённом соотношении. Подвижная фаза должна удовлетворять следующим требованиям:

• не должна вступать в химические взаимодействия ни с разделяемыми компонентами, ни с неподвижной фазой;

• быть малотоксичной и содержать минимум компонентов (результаты, получаемые при использовании многокомпонентных элюентов, как правило, трудно воспроизводимы);

• должна быстро испаряться с поверхности хроматограммы;

Подвижную фазу подбирают в соответствии со свойствами разделяемых веществ. Так полярные вещества следует разделять в полярных растворителях, малополярные – в менее полярных или неполярных растворителях. Для подавления диссоциации компонентов разделяемой смеси к подвижной фазе часто добавляют вещества кислого или основного характера.

Для характеристики полярности подвижной фазы в методе ТСХ используются те же характеристики (элюирующая сила и полярность), что и в колоночной хроматографии.