Метод нейтрализации

Основан на нейтрализации вируса антисывороткой, что изменяет свойства вириона, например, по отношению к эритроцитам.

РТГА - реакция торможения гемагглютинации.

Реакция может быть направлена на определение антител к вирусу в сыворотках или на обнаружение вируса в материале.

Для реакции необходимо:

1. Эритроциты кур.

2. Гемагглютинирующий вирус.

3. Антисыворотка к вирусу.

4. Раствор Альсевера - растворитель.

5. Забуференный раствор 0,85 % хлорида натрия

5. Пипетки, пластины типа Такачи, пробирки.

1. Определение антител в сыворотке.

В стерильный флакон (250 мл) вносят 50 мл раствора Альсевера. В стерильный шприц на 50 мл с иглой 7-9 см насасывают 15 мл раствора Альсевера из флакона и делают пункцию сердца взрослой курицы, набирая 15 мл крови в шприц. Иглу снимают, шприц покачивают, перемешивая жидкость. Затем кровь выливают во флакон. Эритроциты отмывают в растворе Альсевера и делают в этом же растворе 4 % взвесь.

Геммагглютинирующий вирус готовят из вирусной суспензии, получая взвесь цельного гемагглютинирующего вируса (ГВ).

Первым подготовительным этапом является определение титра ГВ, путем титрования вируса. В микротитраторах типа Такачи в двух паралллельных рядах делают разведения вируса от 1:5 до 1:2560. Для этого, капельницей вносят растворитель рН 7,2 по 0,05 мл (две капли) во все лунки, начиная со второй. В первую лунку вносят гемагглютинирующий вирус (ГВ) в разведении 1: 5 в объеме 0,1 мл. С помощью микротитровальных петель объемом на 0,05 мл или дозатора делают разведения, как обычно. Затем в каждую лунку вносят по капле 0,5 % взвеси эритроцитов курицы. Пластины легко встряхивают и оставляют на 30 мин для оседания эритроцитов.

За титр ГВ принимают последнее его разведение, где отмечена полная гемагглютинация. Для РТГА используют 4 гемагглютинирующих единицы. Для этого разведение ГВ, дающее титр реакции, следует сконцентрировать в 8 раз (разделить на 8). После этого необходимо сделать контроль правильности выбора 4 полученных единиц. Для этого делают несколько последовательных разведений, начиная с 4 ГЕ (в первой лунке), далее 2 ГЕ (вторая лунка), 1 ГЕ в третьей лунке и 0,5 ГЕ в четвертой лунке. Во все лунки вносят эритроциты. Если ГЕ выбраны правильно, то реакция вирусной гемагглютинации будет наблюдаться в первых трех лунках.

Постановка опыта. Микрокапельницей вносят со 2 по 10 лунку микропланшета по 0,025 мл растворителя (опытный ряд) и со 2 по 5 лунку второго ряда контрольного. Затем в первые лунки двух рядов добавляют по 0,05 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:5.

С помощью петель с головками на 0,025 мл или дозаторов титруют сыворотку как обычно. Затем во все лунки первого ряда вносят по 1 капле суспензии ГВ, содержащей 4 ГЕ, а в контрольный ряд - по 0,025 мл растворителя.

Пластины оставляют на 30 мин при комнатной температуре. После этого, во все лунки двух рядов закапывают по 1 капле 0,5 % взвеси эритроцитов курицы и пластины вновь оставляют на 60 мин. Начинают учет с контрольного ряда, где эритроциты оседают в виде маленького колечка или пуговочки. Если в сыворотке присутствуют антитела, гомологичные ГВ, то в первых лунках первого ряда будет нейтрализация вируса антителами.

Это должно проявиться отсутствием гемагглютинации в первых лунках. В последующих лунках первого ряда сыворотка теряет концентрацию (учитывая последовательные ее разведения) и не может нейтрализовать весь вирус, поэтому в этих лунках будет наблюдаться положительная реакция гемагглютинации - в виде зонтика. Если антител не было, то во всех лунках будет гемагглютинация.