2 Этап. Титрование комплемента.

Готовят ряд пробирок: в первую из них вносят 0,05 мл комплемента в разведении 1:10, во вторую - 0,1 мл комплемента, в третью - 0,15 мл, в четвертую - 0,2 мл, в пятую - 0,25 мл, в шестую - 0,3 мл, в седьмую - 0,35 мл, в восьмую - 0,4 мл, в девятую- 0,45 мл, в десятую - 0,5 мл. Одиннадцатая пробирка контрольная, которая содержит 0,5 мл растворителя.( таблица № 22).

Во все пробирки доливают растворитель до общего объема 0,5 мл, а затем вносят во все пробирки по 1 мл индикаторной системы и оставляют на 30 мин при 37 ^о С. После этого, все пробирки просматривают и выбирают наибольшее разведение комплемента, вызывающее гемолиз - это титр комплемента.

Таблица № 22.

Схема титрования комплемента (количество пробирок сокращено)

Ингредиенты	Номера пробирок и количество ингредиентов, мл
	1	2	3	4	5	6		7	8
Комплемент 1:10	0,05	0,06	0,07	0,08	0,09	0,1		0,14
Растворитель	0,45	0,48	0,49	0,4	0,48	0,5		0,42	0,5
Разведения	1:100	1:90	1:80	1:70	1:60	1:50		1:40
Гемсистема	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5		0,5	0,5
Экспозиция 45 мин при комнатной температуре
Результат	гемолиз	гемолиз	гемолиз	гемолиз	осадок		осадок	осадок	осадок
Рабочая доза комплемента	Титр комплемента составляет 1:70, значит рабочая доза комплемента: (1:70х30):100= 1:21

В реакцию берут разведение комплемента на 30 % выше, чем его титр, это рабочая доза комплемента.

3 этап. Приготовление индикаторной системы. К 3 % взвеси нативных эритроцитов барана добавляют равный объем гемолитической сыворотки в рабочем разведении. Смесь выдерживают 30 мин при 37^о С и осадок эритроцитов трижды отмывают растворителем при осаждении или центрифугировании при 500 об\мин в течение 10 мин. Осадок эритроцитов ресуспендируют до 3 % взвеси.

Постановка РСК. Титруют исследуемую сыворотку крови в пробирках от 1:50 до 1:12800 и делают контроли: на сыворотки (исследуемую, положительную и отрицательную), антиген, комплемент. Во все разведения сыворотки, кроме контроля сыворотки, вносят по 0,5 мл антигена. В контроль сыворотки, комплемента и антигена вносят по 0,5 мл растворителя. (таблица № 23).

Смесь встряхивают и во все пробирки добавляют по 0,05 мл комплемента в рабочей дозе. Смесь оставляют на 60 мин при 37^о С

После экспозиции в каждую пробирку вносят по 1,0 мл индикаторной системы. Смесь встряхивают и выдерживают 60 мин при 37^о С.

. При наличии в сыворотке гомологичных антител, комплемент расходуется на комплекс антиген-антитело первой системы. Это проявляется отсутствием лизиса индикаторных эритроцитов. При отсутствии антител в сыворотке комплемент не расходуется и тогда взаимодействует со второй системой (индикаторной). При этом эритроциты лизируются в первых пробирках.

Реакция связывания комплемента позволяет определять антитела, микробы, вирусы, растворимые антигены, однако он трудоемок и вытеснен при некоторых инфекциях другими методами.

Таблица № 23.

Схема постановки РСК

Дополнительные сведения Ингредиенты	Номера пробирок и количество ингредиентов, в мл
	1	2		3		4			5			6			7			8
	Разведения исследуемой сыворотки							Контроли
								сыворот- ка (+)			сыворот- ка (_ )			компле- мент			исслед. сывор.			антиген
Растворитель	0,5		0,5		0,5								0,5			0,5			0,5
Исслед. сыворотка 1:50	0,5		-		-											0,5
Разведения	1:100		1:200		1:400											1:100
Антиген	0,5		0,5		0,5		0,5			0,5			0,5			-			0,5
Комплемент	0,5		0,5		0,5		0,5			0,5			0,5			0,5			0,5
Заведомо отриц. сыв.										0,5
Заведомо полож. сыв.							0,5
Экспозиция 60 мин при 37о с
Гемсистема	1,0		1,0		1,0		1,0			1,0			1,0			1,0			1,0
Экспозиция 60 мин при 37о С
Результат РСК	осадок		осадок		осадок		осадок			гемолиз			гемолиз			гемолиз			гемолиз
Результат анализа	Исследуемая сыворотка содержит антитела, на что указывает осадок в первых пробирках с сывороткой и положительным контролем, при отрицательной реакции (гемолиз) в других контролях

Феномен иммунофлюоресценции

Объединяет большую группу методов и реакций, основанных на использовании свечения в люминисцентном микроскопе антител, меченых флюорохромом.

Непрямой метод.

РИФП - реакция иммобилизация прямая.

Для проведения реакции необходимо иметь:

1. Предметные стекла.

2. Иммунные сыворотки, меченые флюорохромом.

3. Антиглобулиновые сыворотки, меченые флюорохромом.

4. Исследуемый материал (микробы, культуры и пр.).

5. Растворитель - 0,85 % раствор хлорида натрия.

На обезжиренное предметное стекло делают мазки исследуемого материала или мазки-отпечатки. Препараты подсушивают, фиксируют смесью Никифорова. На мазок наносят иммунную сыворотку, специфичную в отношении предполагаемого в материале микроба, меченую флюорохромом. Препарат ставят во влажную камеру на 30 мин при 37^о С, а затем промывают в растворителе и ополаскивают в дистиллированной воде 10 мин, сушат при 18-20^О С и исследуют в люминисцентном микроскопе с иммерсионной системой.

Если микробы в мазке есть, то вокруг них будут скопления зеленого специфического свечения, а фон может равномерно слабо светиться. Это меченые антитела окружили гомологичную клетку. Оценку интенсивности специфического свечения ведут по 4-кресной системе: ++++ или +++ яркая флюоресценция, ++ и + слабая флюоресценция клеток.