5.1.Условия культивирования.

Для успешного культивирования изолированных клеток и тканей растений необходимо соблюдать определенные условия их выращивания (температуры культивирования, активной кислотности среды, степени аэрации, скорости работы мешалки).

Большинство каллусных тканей не нуждаются в свете, т.к. не имеют хлоропластов и питаются гетеротрофно. В некоторых случаях каллусные ткани, не способные к автотрофному питанию, все же выращивают при непрерывном освещении, что является необходимым условием дальнейшего успешного морфогенеза, как у люцерны. Большинство же каллусных тканей получают в темноте или при рассеянном свете.

Влажностьв культуральной комнате должна составлять 60-70 %. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, изменению ее концентрации и нарушению условий культивирования. Для увеличения влажности воздуха в комнате можно использовать поддоны с водой.

Оптимальная температурадля большинства культивируемых тканей 25-26 ˚С, для культуры тканей тропических растений она может достигать 29-30 ˚С. В случае индукции морфогенеза температуру понижают до 18-20 ˚С.

Особое внимание при развитии продуцента в ферментерах следует уделять пеногашению.При продувании воздуха через биореактор происходит обильное пенообразование, нарушающее протекание всего процесса развития продуцента. Основной причиной образования избыточного количества пены является высокая вязкость питательной среды, обусловленная обильным накоплением биомассы. Для борьбы с пеной в ферментерах при получении биомассы используют различные поверхностно-активные вещества (растительные и минеральные масла, спирты и жирные кислоты и др.).

Выращивание ткани проводят в течение 70 сут. В период ростового цикла осуществляют микробиологический, биохимический и визуальный контроль. Визуальный контроль проводят не реже 1 раза в 10 дней – отбраковывают инфицированные ткани.

5.2. Аппаратурное оснащение фитобиотехнологических производств.

Особенностями растительных клеток являются: склонность к объединению в тканевые структуры, которые в целостном организме «омываются» жидкостями определенного состава, содержащими многие регуляторные вещества, оказывающие заметное влияние на функцию тканей; малые скорости роста и развития растительных клеток, а некоторые из них вообще не культивируются в глубинных условиях на жидких питательных средах; хемогетеротрофизм растущих клеток в культуре; синтез целевого продукта лишь агломератами клеток.

В зависимости от вида и потребностей клеток их культивируют в разных биореакторах (с механическим перемешиванием, колонного типа с перемешиванием). Фирма «Sigma» (США) выпускает мембранные наборы для растительных культур тканей, что позволяет исключить ингибиторы, нередко присутствующие в агар-агаре и других желирующих агентах. Эти наборы предназначены для выращивания протопластированных и других культур, которые могут поддерживаться длительное время без смены культурального контейнера. Мембранные контейнеры имеют квадратную или круглую форму. Их изготавливают из полипропилена. Они пригодны для протока воды 288 л/м²/ч. Мембраны устойчивы к действию сильных кислот, оснований и органических растворителей (за исключением галогенизированных углеводородов).

Также фирма «Sigma» (США) производит так называемый фитатрей (от англ.tray- поднос) для растительных клеточных культур, размером 92 х114 х 89 мм. Каждый фитатрей упаковывают в ящики по 100 кювет и крышек на ящик. Составные части фитатрея стерилизуют-лучами.

6. Предварительная обработка биомассы.

В процессе развития продуцента БАВ почти полностью выделяются из клеток в окружающую среду. Однако в некоторых случаях лишь часть биологически активных веществ выделяется в культуральную среду, а другая часть сохраняется внутри клеток. У ряда продуцентов БАВ они почти полностью содержаться в клетках организма.

При твердофазном способе культивирования из колбы вместимостью 250 мл с выросшей культурой ткани вначале проводят съем сырой биомассы, затем сушку биомассы на противнях при температуре 58С2С. Время сушки биомассы зависит от: начальной влажности биомассы, толщины слоя биомассы, температуры сушки. Окончание сушки определяют на ощупь: не должно быть мягких влажных комочков. Остаточная влажность биомассы после сушки не более 12 %. Затем сухую биомассу подают на стадию выделения и очистки БАВ с аналитическим паспортом на содержание БАВ.

При глубинном культивировании, если БАВ находится в культуральной жидкости, его выделяют методами экстракции растворителями, несмешивающимися с жидкой фазой или осаждают в виде нерастворимого соединения, или сорбируют ионообменными смолами.

Выделение БАВ из клеток организма-продуцента осуществляют экстракцией органическими растворителями. Если БАВ содержится и в культуральной жидкости, и в клетках продуцента, первичной операцией его выделения является перевод в фазу, из которой наиболее целесообразно его изолировать. Для этого БАВ, содержащееся в культуральной жидкости и в клетках продуцента, переводят в осадок, а затем его экстрагируют.

Отделение нативного раствора от биомассы и взвешенных частиц проводят методами фильтрации или центрифугирования. Для фильтрации применяют: фильтр-прессы (для обработки больших объемов культуральной жидкости), нутч- и друк-фильтры (для фильтрования небольших объемов культуральной жидкости).

Отделение мицелия или других взвешенных частиц может также происходиить в сепараторах. При скорости вращения барабана, равной 7000 – 7500 об/мин, благодаря центробежной силе, твердые частицы устремляются к стенкам барабана, где и осаждаются, а отсепарированная жидкость

7. Выделение и очистка БАВ.

В процессе образования БАВ в биомассе (твердофазный способ культивирования) и в культуральной жидкости (глубинный способ культивирования) наряду с присутствием в них различных неиспользованных компонентов среды выделяются и разнообразные продукты обмена, продукты автолиза клеток.

Стадия выделения и химической очистки включает ряд процессов: от обработки нативного раствора до сушки готового очищенного препарата. На этой стадии, в зависимости от свойств БАВ, его химического строения и места локализации применяют различные методы выделения и очистки. В качестве основных методов используют экстракцию, осаждение, сорбцию, мембранные методы очистки, кристаллизацию, выпаривание, сушку.

Особенностью стадии выделения и очистки является работа с весьма невысокими концентрациями выделяемого вещества (не более 2 %). В конце стадии очистки уже имеют дело с более высокими концентрациями БАВ, достигающими 20 – 30 %.

Цель очистки – извлечение БАВ из нативной жидкости или из клеток продуцента, концентрация его и освобождение от сопутствующих примесей и в конечном счете получение высокоочищенного препарата.

БАВ растительного происхождения под влиянием жестких внешних факторов легко теряют свои свойства, инактивируются, поэтому при их выделении и очистке необходим максимум осторожности.

8. Получение готового продукта.

К БАВ биотехнологического происхождения, применяемым в медицине, предъявляются очень высокие требования:

• высокая степень очистки;

• фармакологическая активность;

• стерильность.

Поэтому на данном этапе работы, а также при химической очистке лекарственного препарата необходимо соблюдать высокую степень чистоты на всех стадиях и операциях – поддерживать в исключительной чистоте не только применяемое оборудование, но и помещения.

После выделения и химической очистки БАВ, его необходимо высушить – удалить из препарата свободную и связанную воду. Поскольку некоторые БАВ, полученные по этой технологии, в той или иной степени термолабильны, для их высушивания необходимо применять методы, не приводящие к потери биологической активности и не изменяющие цвет препарата.

На современном этапе получения БАВ используют различные методы обезвоживания препарата. Помимо обычных методов сушки, широкое распространение получила лиофильная сушка БАВ, которая проводится при сравнительно низких температурах (- 8, - 12 С).

Погрессивным методом при работе с большим количеством раствора, содержащего БАВ, является высушивание с применением распылительных сушилок. Раствор БАВ пневматически распыляется до мельчайших капель в рабочей камере сушилки потоком нагретого воздуха. Процесс высушивания БАВ протекает в течение нескольких секунд и при этом даже термолабильные вещества не меняют своих свойств.

Фасовку порошков производят во флаконы оранжевого стекла.

Готовый порошок подвергается тщательному аналитическому, биологическому и фармакологическому контролю.