4.2. Подготовка питательных сред.

4.2.1. Особенности стерилизации питательных сред.

Стерилизация питательных сред в промышленных условиях осуществляется двумя основными методами: периодическим и непрерывным.

Периодический метод стерилизации.

Этот метод стерилизации при использовании небольших объемов среды. Он заключается в том, что среда, нагретая до определенной температуры (120 – 125 С) непосредственно в ферментерах или специализированных паровых стерилизаторах, выдерживается при этой температуре в течение 30 – 60 мин., после чего охлаждается до 27 – 30С.

Непрерывный метод стерилизации.

Непрерывный метод стерилизации целесообразно применять при использовании больших объемов среды. Приготовленная среда из специального сосуда с помощью насоса подается в стерилизационную колонну, через которую пропускается острый пар (давление пара около 5 атм). Пар подается сверху по внутренней трубе, имеющей щелевидные прорези, благодаря чему пар поступает в среду и быстро ее нагревает. Среда в колонну подается снизу и движется по спирали вокруг внутренней трубы.

Нагретая в колонне до необходимой для стерилизации температуры (около 125 С), среда поступает в специальной аппарат – выдерживатель, где она выдерживается при температуре 120 – 125С. Время выдерживания зависит от состава среды и составляет 5 – 10 мин. Из выдерживателя стерильная среда поступает в змеевиковый холодильник, где она охлаждается до 30 – 35С и затем поступает в фераментер. Непрерывный метод стерилизации имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим методом:

• возможность автоматического регулирования процесса;

• быстрый и равномерный нагрев среды;

• обеспечение более полной стерильности.

4.2.2. Химический состав питательных сред.

Питательные среды для культивирования изолированных растительных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы (азот, фосфор, калий и др.) и микроэлементы (бор, марганец, цинк и др.), а также витамины, углеводы, фитогормоны или их синтетические аналоги.

Компоненты среды для выращивания каллусных культур можно подразделить на 6 групп:

1. основные неорганические питательные вещества (макроэлементы);

2. микроэлементы;

3. источники железа;

4. органические добавки (витамины);

5. источники углерода;

6. регуляторы роста растений.

Макроэлементы.

Большое внимание на синтез вторичных метаболитов оказывает минеральный состав среды. При этом наиболее значимыми являются азот, фосфор, калий. Однако их влияние очень специфично как в отношении вида растения, так и в отношении того или иного продукта, очищенной чем свидетельствуют следующие примеры. Так, если у одних культур органические формы азота – пептон, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина – тормозят накопление вторичных метаболитов, то у других повышают их синтез. Соотношение аммонийного и нитратного азота в питательной среде также имеет значение. Например, увеличение нитратного азота в среде приводило к повышению синтеза диосгенина культурой клеток диоскореи.

Азотдобавляется в форме нитратов, перерабатывающихся клетками с помощью фермента нитратредуктазы.

Микроэлементы.

К, безусловно, необходимым микроэлементам относятся бор, марганец, йод, медь, кобальт, молибден. Так, недостаток марганца препятствует синтезу белков, уменьшает количество РНК и приводит к увеличению содержания свободных аминокислот. Железо имеет значение для деления ядра и для деятельности дыхательных ферментов.

Витамины.

К активным веществам, играющим существенную роль в культуре тканей, принадлежат витамины. Так, тиамин(анейрин, витамин В₁) участвует в процессе роста корней. Многократные пассажи (посевы клеток) кончиков корней без него невозможны. Для роста корней, помимо питательных веществ и тиамина, необходимы и другие витамины. Например, горох и редис нуждаются в никотиновой кислоте,. На томаты благоприятно действуетвитамин В₆ (еще лучше совместное его применение с никотиновой кислотой), тогда как лен может обойтись одним тиамином.

В зернах злаков тиамин находится алейроновом слое, и, следовательно, не может присутствовать в полированном рисе. Поэтому преимущественное его употребление его в пищу населением Восточной Азии привело к вспышкам болезни бери-бери.

При автоклавировании тиамин расщепляется на пиримидин и тиазол. Для роста корней томата, оказывается, достаточно одного тиазола, а для некоторых фитопатогенных грибов – только пиримидина (при необходимости организм сам синтезирует второй компонент тиамина).

Аскорбиновая кислота (витамин С) важна для роста побегов. Введение аскорбиновой кислоты ускоряет укоренение черенков и стимулирует прорастание пыльцы. Предполагают, что она имеет отношение к обмену ростовых веществ. Действие аскорбиновой кислоты основано на ее окислительно-восстановительных свойствах: в окисленной форме аскорбиновая кислота превращается в вещество, тормозящее рост. Не исключено, что она вызывает активирование ростового вещества в неактивной форме.

Культивируемые штаммы дрожжей нуждаются для своего развития в веществах биоса – комплексе витаминов. К биосу принадлежат:мезоинозит, биотин (витамин группы В) ипантотеновая кислота. Впрочем,пантотеновая кислота может быть заменена-аланином, при помощи которого дрожжи, вероятно, сами синтезируют пантотеновую кислоту. Дрожжи нуждаются и в тиамине. Данные вещества природные штаммы дрожжей синтезируют сами, а вот культуральные дрожжи такую способность утратили – у них наблюдают постепенно усиливающуюся гетеротрофность – склонность к питанию готовыми органическими веществами и потерю способности к синтезу одного или нескольких активных веществ биоса.

В никотиновой кислоте нуждаются корни некоторых растений. Она встречается постоянно у высших и низших растений.

Пиридоксин(адермин, витамин Ве) усиливает рост корней, например, у томатов и моркови.

Органические соединения.

Углеводы.

Важнейшим фактором среды, влияющим на накопление биомассы, являются углеводы. Поскольку в основном клетки invitroгетеротрофны, то обычно в качестве источника углерода используется сахароза. Конкурировать с сахарозой может и глюкоза, но все-таки, за редким исключением, рост и высокий уровень биосинтеза в культуре обеспечивает именно сахароза. Повышенные концентрации сахарозы обычно приводят к увеличению выхода вторичных метаболитов. Вместе с тем высокие концентрации сахарозы повышают осмотический потенциал среды, влияние которого на метаболизм культивируемых клеток не изучено. В то же время увеличение содержание сахара в среде удорожает производство, поэтому поиск дешевых углеводных добавок остается актуальным.

Органические добавки неопределенного состава.

Органические добавки неопределенного состава, такие, как гидролизат казеина и кокосовое молоко, могут оказывать буферное действие. Буферная емкость сред очень низкая, поэтому величина исходного рН 5 – 6 при культивировании быстро сдвигается на несколько единиц, а это, в свою очередь, сказывается на биосинтетических свойствах и способности к накоплению продукта культивируемых клеток.

Фитогормоны.

Фитогормонынеобходимы длядедифференцировки клетоки дляиндукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред должны обязательно входитьауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку ицитокинины, индуцирующие деление клеток. В качестве источников ауксинов в питательных средах используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), индолил-3-уксусную кислоту (ИУК), α-нафтилуксусную кислоту (НУК). Для получения рыхлого хорошо растущего каллуса чаще применяют 2,4-Д, т.к. ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д.

М. Ценк с сотрудниками изучили влияние 146 соединений с ауксиновой активностью на рост и образование антрахинонов у культуры клеток моринды лимонолистной (Morindacitrifolia) из семейства мареновых. Они установили, что многие из них поддерживали хороший рост клеток, но только два: альфа-нафтилуксусная кислота и 2, 3, 6-трихлорбензойная кислота – наряду с поддержанием роста стимулировали образование антрахинонов.

Ауксины.

В начале Второй мировой войны был открыт ауксин. Вначале его получали из верхушки колеоптиля (бесцветного чехла, защищающего первый молодой лист кукурузы). Но это был поистине каторжный труд: за 10 дней 8 лаборанток немецкого биохимика Ф. Кегля проработали 100 тыс. проростков и получили в результате количество активного вещества, достаточное лишь для установления кислой природы ауксина. Для того чтобы таким путем добыть из клеоптилей кукурузы 250 мг ауксина, лаборанткам пришлось бы проработать не прерываясь на сон и еду 400 лет.

К счастью, вскоре был найден обильный и доступный источник ауксина. Им оказалась человеческая моча.

Под названием ауксинобъединен целый ряд веществ – регуляторов роста. Важнейшее из них получило наименованиегетероауксина и представляет собой-индолилуксусную кислоту, или ИУК. ИУК в изобилии образуется микроорганизмами – дрожжами, грибами, бактериями.

ИУК эффективно используют для ускорения образования корней из черенков плодово-ягодных и других растений. В настоящее время синтезирован целый ряд ауксинов, среди которых особенно большой активностью обладает -нафтилуксусная кислота (НУК).

Близко к группе гетероауксинов стоят гербициды,представляющие собой производные феноксиуксусной кислоты. В культуре клеток, тканей и органов чаще всего применяют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), 2,4,6-трихлорфеноксиуксусную кислоту и 2-метил-4-хлорфеноксиуксусную кислоту, которые обладают активностью и используются как свободные кислоты, так и растворимые в воде натриевые и аммонийные соли этих кислот, а также их эфиры. Кроме того, идут в дело еще и этаноламиновые соли. Эти гербициды были открыты одновременно в начале второй мировой войны в США и Великобритании.

2,4-Д может заменить гетероауксин в культуре ткани, причем он в 10 с лишним раз активнее последнего вызывает образование корней, распад крахмала, усиливает дыхание. Очень малые концентрации гербицида действуют благоприятно на прорастание семян и на развитие микроорганизмов.

Цитокинины.

Значительно позднее был открыт ряд соединений, оказывающих сильное стимулирующее действие на деление растительных клеток – цитокининов.

В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используют кинетин, 6-бензиламинопурин (6-БАП), зеатин. 6-БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза по сравнению с кинетином. Очень активным соединением явилась дефинилмочевина, выделенная из кокосового молока.

5. Биосинтез БАВ.

Стадия биосинтеза – основная биологическая стадия процесса получения БАВ на основе культуры растительных тканей.

Задача этой стадии – обеспечение для продуцента БАВ таких условий развития, которые бы обеспечивали максимальный уровень биосинтеза БАВ. Эффективность данной стадии зависит от уровня образования БАВ и определяется генетическими особенностями организма, составом питательной среды, режимом развития продуцента, от времени максимального образования БАВ, стоимости компонентов среды, пеногасителей, энергетических затрат, связанных с развитием продуцента.

В настоящее время производство БАВ из культуры тканей осуществляют двумя способами ферментации: культивирование на поверхности твердой среды (твердофазная ферментация) и погруженное глубинное культивирование (суспензионное).