Сигнальные молекулы, действующие по фосфоинозитидному пути

Гормоны	Прочие сигнальные молекулы
Тиреолиберин Гонадолиберин Соматотропин Вазопрессин (через V1-рецепторы) Окситоцин Адреналин (через α1-адренорецепторы)	Ангиотензин II Брадикинин Гастрин Холецистокинин ВИП Ацетилхолин (через М-холинорецепторы)

Важным моментом в передаче сигналов по этому пути является активирование фермента фосфолипазы С, которая расщепляет минорные фосфолипиды плазматических мембран фосфатидилинозитол-4, 5-бисфосфаты (рис. 4.9). Образующиеся диацилглицеролы (ДАГ) и 1, 4, 5-трифосфоинозитолы (ИФ₃) играют роль вторичных посредников.

Как и в случае аденилатциклазного механизма первичными посредниками здесь являются G-белки, но не абсолютно те же, а несколько отличающиеся –G_plc-белки.

ДАГ и ИФ₃инициируют в клетках-мишенях два отдельных каскадных механизма (рис. 4.10). ДАГ, оставаясь в плазматической мембране, активирует протеинкиназу С.

В структуре этого фермента выделяют два домена: регуляторный и каталитический. Первый, имея высокое сродство к ионам кальция и максимально активируясь в его присутствии, присоединяет ДАГ. Конформационные изменения затрагивают каталитическую субъединицу и фермент становится активным. Протеинкиназа С фосфорилирует белки, имеющие отношение к пролиферации клеток (белки цитоскелета и ядерного хроматина, митогены, факторы роста). Следует отметить, что уровень Са²⁺в цитозоле клеток зависит от второго внутриклеточного посредника (ИФ₃), хотя он и сам по себе является вторичным посредником.

Каким образом ИФ₃повышает содержание Са²⁺в цитозоле клеток? ИФ₃усиливает его мобилизацию из цистерн эндоплазматического ретикулума, а, превращаясь в 1, 3, 4, 5-инозитолтетрафосфат (ИФ₄), открывает в плазматических мембранах «медленные» неэлектрогенные лиганд-зависимые кальциевые каналы, обеспечивая поступление Са²⁺в клетки из внеклеточного матрикса в цитоплазму.

Действие Са²⁺опосредовано специальными Са²⁺-вязывающими белками кальмодулином, аннексином. Кальмодулин представляет из себя белок (Mr17 кДа), имеющий четыре участка связывания Са²⁺. При повышении уровня этого иона в цитозоле до ≥10^-5моль/л образуются активные Са²⁺-кальмодулиновые комплексы, способные изменять функциональное состояние разных белков. Они активируют кальций-зависимые аденилатциклазу и гуанилатциклазу, а в некоторых типах клеток, стимулируя фосфодиэстеразу, гасят сигналы, передаваемые по аденилатциклазному пути. Кроме того, Са²⁺-кальмодулиновые комплексы активируют различные протеинкиназы, в том числе протеинкиназу С, которые, например, в гладких мышцах фосфорилируют легкие цепи миозина и инициируют их сокращение. В париетальных клетках стенки желудка киназы фосфорилируют и этим стимулируют функцию Н⁺, К⁺-АТФ-азы, обеспечивающей секрецию Н⁺для последующего образованияHCl. В разных тканях Са²⁺-зависимая протеинкиназа активирует киназу липомодулина. Этот мембранный белок повышает активность фосфолипазы А₂и стимулирует в конечном итоге биосинтез эйкозаноидов (простагландинов, тромбоксанов, простациклинов, лейкотриенов).

В мышцах Са²⁺активирует особую форму киназы фосфорилазы В, стимулирующую гликогенолиз. Этот механизм реализуется адреналином через α₁-адренорецепторы.

Терминация эффектов кальмодулина происходит при его взаимодействии с кальций-связывающими белками типа кальцийнейрина. Кроме того, сам Са²⁺активирует Са²⁺-АТФ-азу, обеспечивающую удаление его туда, откуда он поступал в цитозоль (ВКМ, цистерны ЭР). И, наконец, вторичные посредники ИФ₃и ДАГ могут удаляться путем вовлечения в ресинтез минорных фосфатидилинозитолов. Все это приводит к прекращению передачи гормонального сигнала.

Рис. 4.10. Фосфоинозитидный путь действия сигнальных молекул: Pg – простагландины; Lt – лейкотриены; Tx – тромбоксаны; Pg I₂.

4. Путь включения Са²⁺неэлектрогенных медленных каналов.

Уже отмечено в предыдущем разделе, что эти каналы в плазматических мембранах открываются под воздействием инозитол-1, 3, 4, 5-тетрафосфата (ИФ₄). Однако в ряде случаев эти каналы могут включаться напрямую гормон-регуляторными комплексами или черезG-белки. Таких информонов известно несколько (табл. 4.3).

Таблица 4.3.

Информоны, напрямую действующие на медленные неэлектрогенные Са²⁺ каналы.

Гормоны	Другие информоны
Соматолиберин Тиреолиберин Гонадолиберин Вазопрессин (через V1-рецепторы)	Гастрин Холецистокинин

Данный путь накопления Са²⁺в клетке является менее эффективным, чем фосфоинозитидный, но при достижении уровня Са²⁺ в цитозоле ≥ 10^-5моль/л их эффекты совпадают (см. раздел №4, стр. ).

5. Тирозинкиназный путь.

Его включают рецепторы, обладающие тирозинкиназной активностью (см. рецепторы первого типа, рис. 4.1, 4.12, 4.14), или инициирующие ее у других белков (рис. 4.15). Уникальность этих протеинкиназ состоит в том, что они фосфорилируют белки не по остаткам серина, треонина, как это традиционно делают другие протеинкиназы, а по радикалам тирозина. Рецепторы – собственно тирозинкиназы (инсулиновый, фактора роста эпидермиса и др.) активируют необычный сигнальный путь (Ras-путь), особенностью которого является отсутствие низкомолекулярных вторичных посредников. Все его участники представлены белками. Один из нихRasG-белок, давший название всему пути. Это небольшой мономерный ГТФ-связывающий белок, обладающий ГТФ-азной активностью. В неактивном состоянииRas-белок прикреплен к внутренней поверхности плазматической мембраны и связан с ГДФ. В активной его форме ГДФ заменен на ГТФ.

Как же реализует инсулин свою информацию в клетках-мишенях?

а) После связывания с гормоном рецептор аутофосфорилируется по тирозиновым радикалам и активируется.

б) Это приводит к фосфорилированию находящихся в цитоплазме белков-субстратов инсулинового рецептора (IRS). См. рис. 4.11. Известны разные их варианты.

в) Эти субстраты инициируют в клетках несколько видов дальнейших превращений. Один из них связан с активированием RasG-белков. При этом образуется комплекс, включающий четыре компонента: 1 – фосфорилированный инсулиновый рецептор (IR-тир-О-Р); 2 – фосфорилированный субстрат инсулинового рецептора (IRS-тир-О-Р); 3 –GEF; 4 –SOS-белок (сокращеня расшифрованы в комментариях к рис. 4.11). Комплекс инициирует изменения, происходящие дальше сRasG-белками. Вначале вRasG-белке происходит замена ГДФ на ГТФ. Это очень похоже, хотя и не полностью, на активированиеG-белков, ассоциированных с рецепторами третьего типа (рис. 4.4).Ras-ГТФ-белок обладает ГТФ-азной активностью, то есть он сам себя постепенно инактивирует и возвращается в инертную форму (Ras-ГДФ-белок). Показано, что ГТФ-азная его активность стимулируется специальнымGAP– 5. См. рис. 4.11.

Рис. 4.11. Схема активирования и последующего аутоинактивирования Ras G-белка.

1 - фосфорилированный инсулиновый рецептор (IR-тир-О-Р); 2 - фосфорилированный субстрат инсулинового рецептора (IRS-тир-О-Р от англ. Insuline Receptor substrate); 3 – GEF, осуществляющий обмен ГТФ (от англ. GTF-ase Exchange Factor); 4 – SOS-белок (от англ. Son of Sevenless – белок, участвующий в этом сигнальном пути, получивший название по имени соответствующей мутации гена (Sevenless mutation) у мушки дрозофилы; 5 – GAP от англ. GTP-ase Activatiny Protein.

г) На пике своей активности Ras ГТФ-белок фосфорилирует и этим стимулирует функцию следующего компонентаRaf-1-белка, представляющего из себя протеинкиназу серин-треонинового типа.Raf-1-белок в неактивном состоянии находится в цитозоле. Он комплексирован с шаперонами. Его активированиеRasГТФ-белком – сложный многоэтапный процесс.

д) Активная Raf-киназа стимулирует каскад реакций фосфорилирования по серин/треониновому типу. Изменяется функциональное состояние нескольких белков, в частности, митоген активируемых протеинкиназ (МАП). Последние активируются в две стадии: вначале фосфорилируется киназа МАП, а потом ею активируются и они сами.

е) Мишенями МАП являются белки-эффекторы, также как протеинкиназа рр90S6, фосфорилаза А₂, белки рибосом, а также переносчики сигнала и активаторы транскрипции (ПСАТ). В их число входятGun-, Fos-факторы и др.

Здесь следует отметить, что Gun-,Fos-факторы, как и ранее упоминавшиесяRas- иRaf-белки, обязаны своими необычными названиями ретровирусным онкогенам. Оказалось, что эти онкогены имеют в нормальных клетках своих «двойников». И хотя эти нормальные гены кодируют белкиRas-пути, назвали их по онкогенам вирусов.

ж) После димеризации и транслокации в ядро ПСАТ выступают в роли индукторов, узнающих энхансеры. Этим они стимулируют транскрипцию генов, клеточную пролиферацию и дифференцировку.

Инсулин влияет на скорость транскрипции более чем 100 мРНК в клетках печени, скелетных мышц, сердца, жировой ткани.

Обращает внимание, что некоторые факторы транскрипции являются ее репрессорами, узнающими сайленсеры на ДНК. Тогда биосинтез мРНК и соответствующих белков замедляется. Инсулин таким способом подавляет образование фосфоенолпируваткарбоксикиназы и блокирует глюконеогенез.

Окончание гормонального действия через инсулиновые рецепторы наступает под влиянием протеинфосфатаз, возвращающих их в неактивное состояние или их фосфорилирование протеинкиназами по радикалам серина и треонина, их сродство к инсулину.

Еще одним путем снижения чувствительности клеток к инсулину является захватывание ими комплексов рецептор-инсулин внутрь эндоцитозом. Часть рецепторов потом возвращается обратно в мембрану, а часть расщепляется лизосомальными протеиназами.

з) Одной из особенностей Ras-пути является его взаимодействие в нескольких точках с другими регуляторными путями. ТакRaf-1-белок может активироваться не толькоRasГТФ-белком, но и протеинкиназой С – ферментом участником фосфоинозитидного пути (рис. 4.10). И, напротив, некоторые протеинкиназыRas-пути могут иметь в качестве мишеней белки альтернативных регуляторных механизмов.

Например, протеинкиназа рр90S6 каскадного этапаRas-пути рр90S6 стимулирует функцию протеинфосфатазы, которая затем фосфорилирует киназу гликогенфосфорилазы, гликогенфосфорилазу, гликогенсинтазу – регуляторные ферменты метаболизма гликогена по аденилатциклазному пути. Распад гликогена в печени под действием инсулина замедляется, а биосинтез ускоряется. Уже было отмечено, что митогенактивируемые протеинкиназы (МАП) стимулируют функцию фосфорилазы А₂, обеспечивающей образование эйкозаноидов. Это сближает эффекты тирозинкиназного и фосфоинозитидного путей передачи сигналов. Вторичные посредники последнего (ИФ₃, ИФ₄, Са²⁺) через киназу липомодулина также активируют фосфорилазу А₂(рис. 4.10).

Обнаружена способность субстратов (IRS), активируемых инсулин-рецепторным комплексом, стимулировать функцию фосфатидилинозитол-3-киназы (ФИ-3-киназы). Через ряд стадий это приводит к образованию минорных фосфофосфатидилинозитолов и повышению уровня вторичных посредников фосфоинозитидной сигнальной системы ФИ₃, ФИ₄, Са²⁺(рис.4.10).

Считают также, что ФИ-3-киназа в адипоцитах активирует фосфодиэстеразу. Это приводит к торможению липолиза за счет уменьшения внутриклеточной концентрации вторичного посредника аденилатциклазного пути 3'5' цАМФ. ФИ-3-киназа принадлежит способность в мышцах и жировых клетках ускорять встраивание белков транспортеров глюкозы четвертого типа (Глют-4) в плазматические мембраны и стимулировать облегченную диффузию глюкозы из крови в клетки. Уровень глюкозы в крови снижается (рис. 4.13). На жировых клетках было показано, что встраивание Глют-4 завершается уже через 7 минут после связывания инсулина с рецепторами. После удаления инсулина процесс обращается, и через 20 – 30 минут транспортные белки выходят из мембраны в цитоплазму.

Рис. 4.13. Мобилизация Глют-4 под действием инсулина в клетках скелетных мышц и жировой ткани. 1 – инсулиновый рецептор; 2 – гормон инсулин; 3 – Глют-4 в цитозольных везикулах; 4. После образования гормон-рецепторного комплекса везикулы перемещаются к плазматической мембране, сливаются с ней и встраивают Глют-4 в мембрану. После этого происходит облегченная диффузия глюкозы в клетки.

Рис. 4.12. Краткая схема Ras-пути, сигнальных молекул, передающих информацию через рецепторы, ассоциированные с тирозинкиназой, на примере инсулина. Буквами а, б, в, г, д, е, ж, з обозначены основные стадии Ras-пути, характеристика которых дана в тексте (стр. )

IRS – субстрат инсулинового рецептора; Глют-4 – белок-транспортер глюкозы (глюкозный транспортер-4); ФИ₃ – инозитол-1, 4, 5-трифосфат; ФИ₄ – инозитол-1, 3, 4, 5-тетрафосфат; SOS-белок – (от англ. Son of Sevenless), названный по мутации гена у мушки дрозофилы; Gun-, Fos-факторы, Ras-, Raf –белки получили свои названия по названиям ретровирусных онкогенов, «двойниками» которых они оказались в нормальных клетках; МАП – митоген, активирующий протеинкиназу; ПСАТ – переносчики сигнала и активаторы транскрипции.

Глюкозные транспортеры (Глют-4) обнаружены во всех тканях, инсулинзависимые – в жировой и мышечной. Различают их несколько типов (табл. 4.4).

Таблица 4.4.