Тема 1. Строение и функции белков

Лабораторная работа № 1.

Количественное определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом

Принцип метода: Ионы меди в щелочной среде реагируют с белком с образованием комплекса фиолетового цвета. Оптическая плотность образующегося комплекса прямо пропорциональна содержанию белка в пробе.

Линейность метода:10 – 150 г/л.

Норма:62 – 85 г/л.

Общий белок в негемолизированной сыворотке сохраняет стабильность при комнатной температуре (18-25С) в течение 7 дней, при температуре хранения 2-8С в течение 1 месяца в плотно закупоренном флаконе.

Оборудование и реагенты:

1. Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 540 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 18-25С;

2. Секундомер;

3. Автоматические пипетки на 20 мкл и 1000 мкл;

4. Сыворотка крови;

5. Физиологический раствор;

6. Реагент (гидроксид натрия – 600 ммоль/л, калий-натрий тартрат – 32 ммоль/л, сульфат меди – 12 ммоль/л, иодид калия – 30 ммоль/л);

7. Калибратор – калибровочный раствор общего белка, 80,0 г/л.

Проведение анализа

Добавить в пробу:	Холостая проба	Калибровочная проба	Опытная проба
1. Калибратор	--	20 мкл	--
2. Сыворотка	--	--	20 мкл
3. Реагент	1 мл	1 мл	1 мл

Перемешать тщательно содержимое пробирок и инкубировать при температуре 25С в течение 10 минут. Измерить оптическую плотность опытной (А_оп) и калибровочной (А_калиб) проб против холостой пробы при длине волны 540 нм.

Окраска раствора стабильна в течение 30 минут.

Гемолиз и липемия влияют на результат, поэтому для таких проб анализ следует выполнять с бланком по пробе ( 20 мкл сыворотки смешивается с 1 мл физраствора). Измеряется оптическая плотность бланка против физраствора и ее значение вычитается из оптической плотности анализируемой пробы.

Расчет

Содержание общего белка в сыворотке рассчитывают по стандарту (калибратор) по формуле:

Аоп С(г/л) = ------------  Скалиб, Акалиб

где С – концентрация общего белка в анализируемой пробе, г/л;

А_оп– оптическая плотность опытной пробы;

А_калиб– оптическая плотность калибровочной пробы;

С_калиб– концентрация общего белка в калибраторе.

При содержании общего белка в пробе свыше 150 г/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение:Изменения содержания общего белка в сыворотке крови происходят по причине:

1. снижения интенсивности биосинтеза белка в тканях;

2. усиленного распада тканевых белков;

3. нарушения водного баланса;

4. потери белка почками, с кровью.

Гипопротеинемия наблюдается при нефротическом синдроме, синдроме мальабсорбции, заболеваниях кожи (ожог, экзема), массивных кровотечениях, задержке солей и воды (заболевания почек), неправильном питании и голодании. Нарушением синтеза белка, приводящему к снижению его концентрации в сыворотке крови, сопровождаются раковая кахексия, длительные воспалительные процессы.

Гиперпротеинемия наблюдается при состояниях и болезнях, сопровождающихся дегидратацией организма (тяжелые травмы, понос, рвота, сахарный диабет). Она характерна также для хронических воспалительных заболеваний (ревматоидный артрит, диффузные болезни соединительной ткани – коллагенозы, цирроз печени) и острых воспалительных процессов в стадии острой фазы, наблюдается также при макроглобулинемии Вальденстрема.

Лабораторная работа № 2

Выделение глобулинов и альбуминов из яичного белка методом высаливания

Принцип метода:Добавляемые к раствору белка анионы и катионы нейтрализуют заряды в молекуле белка, в результате чего белок теряет гидратную оболочку, являющуюся одним из факторов его устойчивости, что приводит к осаждению белка. Характерной особенностью белков, полученных высаливанием, является сохранение ими неактивных биологических свойств после удаления соли, которое чаще всего проводят методом диализа.

Лабораторная работа № 3

Разделение белков сыворотки крови методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы

Принцип метода: Белки являются амфотерными электролитами. Направление движения белков в электрическом поле зависит от рН среды. Коллоидные частицы белка перемещаются в электрическом поле постоянного тока к аноду – в щелочной среде, к катоду – в кислой среде.

Разделение белков сыворотки обычно проводят в буферном растворе при рН 8,6 – 8,9. В качестве носителя используют пленки из ацетата целлюлозы. В этих условиях заряженные белки сыворотки крови перемещаются по смоченным пленкам из ацетата целлюлозы в направлении анода со скоростью, зависящей от величины заряда и относительной молекулярной массы белка. Этот след представляет собой дорожку, на которой после окрашивания ясно видны места концентрации белков различных фракций. Наиболее быстро движутся альбумины, затем ₁-, ₂-, -глобулины, и, наконец, -глобулины. По этим следам (дорожкам) можно определить содержание белка в различных белковых фракциях пробы. Методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы можно получить 5 и более белковых фракций.

Нормальные величины белковых фракций зависят от вида применяемого красителя:

Белковые фракции	Окраска электрофореграммы
	Пунцовый С	Амидо черный
1. Альбумины	52% (46,9-61,4)	60,2% (50,3-70,1)
2. 1-Глобулины	3,3% (2,2-4,2)	4,4% (2,7-6,1)
3. 2-Глобулины	9,4% (7,9-10,9)	12,3% (9,4-15,2)
4. -глобулины	14,3% (10,2-18,3)	13,0% (7,7-18,0)
5. -Глобулины	21,4% (17,6-25,4)	20,1% (15,2-25,0)

Оборудование и реагенты:

1. Аппарат для электрофореза;

2. Источник постоянного тока;

3. Денситометр;

4. Веронал-мединаловый буфер, рН 8,6;

5. Раствор амидо черного для окрашивания электрофореграммы (амидо черный 250 мг в 100 мл 7% уксусной кислоты);

6. Раствор для отмывания (5-7% уксусная кислота)

7. Раствор для просветления пластинок из ацетата целлюлозы (смесь этанола, уксусной кислоты и глицерина);

8. Сыворотка крови;

9. Дистиллированная вода.

Просветления пластинок из ацетата целлюлозы можно достигнуть также, погрузив пластинки на 2-3 минуты в глицерин или вазелиновое масло.