План лекции:

1. Стадии биотехнологического процесса;

2. Принципиальная схема;

3. Предферментационная стадия;

4. Стадия ферментации, классификация

5. Контроль производства

Важнейшей задачей любого биотехнологического процесса является разработка и оптимизация научно-обоснованной технологии и аппаратуры для него. При организации биотехнологических производств частично был заимствован опыт развитой к тому времени химической технологии. Однако биотехнологические процессы имеют существенное отличие от химических в силу того, что в биотехнологии используют более сложную организацию материи – биологическую. Каждый биологический объект (клетка, фермент и т. д.) – это автономная саморегулирующаяся система.

Природа биологических процессов сложна и далеко не выяснена окончательно. Для микробных популяций, например, характерна существенная гетерогенность по ряду признаков – возраст, физиологическая активность, устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды. Они также подвержены случайным мутациям, частота которых составляет от 10-4 до 10-8. Гетерогенность также может быть обусловлена наличием поверхностей раздела фаз и неоднородностью условий среды.

В общем виде любой биотехнологический процесс включает три основные стадии: предферментационную, ферментационную и постферментационную. Принципиальная схема реализации биотехнологических процессов в общем виде может быть представлена блок-схемой, в которой сделана попытка охватить все варианты ферментационных процессов (рис. 1.1).

Рис. 1.1. Принципиальная схема реализации биотехнологических процессов

(по У. Э. Виестур и др., 1987):

1 – реактор для приготовления сред, 2 – вихревой насос, 3 – аппарат для приготовления твердых сред, 4 – паровая колонка для подогрева сред до температуры стерилизации, 5 – выдерживатель сред при температуре стерилизации, 6 – теплообменник для охлаждения сред, 7 – мерник – сборник питательной среды, 8 – дозатор, 9 – анаэробный ферментер, 10 – глубинный аэробный ферментер, 11 – биокаталитический реактор, 12 – ферментер для поверхностной твердофазной ферментации, 13 – то же для поверхностной жидкостной ферментации, 14 – экстрактор, 15 – сепаратор для отделения биомассы, 16 – система локальной автоматики, 17 – плазмолизатор биомассы, 18 – дезинтегратор биомассы, 19 – выпарная установка, 20 – фракционирование дезинтегратов, 21 – сушилка и другие аппараты для обезвоживания, 22 – аппаратура для расфасовки продукта, 23 – ионообменные колонны, аппараты для химических и мембранных методов выделения, центрифуги, фильтры, кристаллизаторы и др. устройства. Условные обозначения: рН – раствор для коррекции рН, П – компоненты и среды для подпитки, Пос – посевной материал, В – сжатый воздух, ПАВ – пеногаситель, Ср – стерильная питательная среда, БА – биологический агент.

На предферментационной стадии осуществляют хранение и подготовку культуры продуцента (инокулята), получение и подготовку питательных субстратов и сред, ферментационной аппаратуры, технологической и рециркулируемой воды и воздуха.

Подготовка и стерилизация технологического воздуха

Эта подготовительная операция требуется для обеспечения дыхания микроорганизмов — биообъектов, большинство которых являются аэробами. Использовать для аэрации кислород можно, но экономически и по технике безопасности это нецелесообразно. Поэтому используется воздух, который под давлением поступает в ферментер непосредственно с территории предприятия : в Ферментер объемом 50 м³ ежечасно подается порядка 3 000 м³ стерильного воздуха, а время ферментации измеряется сутками.

воздух подвергается не менее чем трех­кратной фильтрации и, как минимум, дважды пропускается че­рез стерилизующие фильтры. При этом, если головной фильтр является общим для всех аппаратов в цехе или вне цеха фермента­ции, то каждый из фильтров тонкой очистки относится к кон­кретному аппарату.

На стадии грубой очистки (головной фильтр) используются волокнистые фильтрующие материалы с волокнами диаметром от 15 до 50 мкм из стекла и базальта и грубозернистые пористые перегородки. Эффективность очистки на этой стадии достигает 98 %. На стадии тонкой очистки (индивидуальные фильтры) приме­няются тонковолокнистые материалы (картон и бумага) с волок­нами диаметром 0,5 мкм; зернистые жесткие фильтрующие пере­городки — керамические и металлокерамические, из разных по­лимеров. Используются также мембранные фильтры.

Постоянное использование фильтров, стерилизующих техно­логический воздух, требует также периодической стерилизации самих фильтров, так как задержанные фильтром микроорганиз­мы могут при благоприятных условиях размножаться. Стерилизация фильтров может быть проведена обработкой ан­тисептиками, ионизирующим облучением и, горячим паром. Температура при обработ­ке паром 120— 125 °С, время обработки 20 — 30 мин.

Герметизация и стерилизация оборудования

Асептические условия производства требуют стерилизации пе­ред началом процесса всей аппаратуры (изнутри) и всех матери­альных потоков. Стерильность дол­жна быть сохранена в течение всего рабочего цикла. Иными сло­вами, технологический процесс должен быть защищен от конта­минации за счет обеспечения герметичности всех соединений в аппаратуре.

В системах, работающих в асептических условиях, должна быть обеспечена возможность стерилизации всех точек внутренних объектов аппаратов и коммуникаций. Для этого перед загрузкой ферментеров через них пропускают насыщенный водяной пар под давлением. Промышленные ферментеры большого объема стерилизуют в течение часа при 125—130"С.

Подготовка и стерилизация питательных сред

Подготовка питательной среды. Микроорганизмы способны ис­пользовать любое органическое соединение, поэтому потенциаль­ными ресурсами для микробиологической биотехнологии могут слу­жить все мировые запасы органических веществ, включая первичные и вторичные продукты фотосинтеза, а также органических веществ в недрах Земли. Так, каменный уголь, природный газ и древесина могут служить сырьем для химического синтеза технических спир­тов или уксусной кислоты, а последние, в свою очередь, являются сырьем для микробиологической промышленности. В микробиоло­гической промышленности основная доля сырья (более 90%) идет н& производство этанола. Производство хлебопекарных дрожжей требу­ет 5% расходуемого в микробиологической промышленности сырья» антибиотиков — 1,7%, органических кислот и аминокислот — 1,65%-

Основными компонентами питательных сред являются источники углерода и азота.

Наиболее распространенным углеродсодержащим сырьем являют-углеводы. Углеводы используются для синтеза клеточных структур ° одновременно служат источником энергии. Для промышленного _сйНтеза наиболее часто применяют глюкозу или крахмал. Кроме _г0 возможно использование органических кислот и спиртов. В качестве источников органического азота могут служить белки, пептиды, свободные аминокислоты. В промышленном производстве обычно используют кукурузный экстракт, соевую муку или гидро-лизат дрожжей. Из минеральных азотсодержащих веществ наиболее часто применяют аммонийные соли серной, соляной или азотной кислот. Наиболее пригодным является сульфат аммония. Влияние источника азота на биосинтез зависит не только от самого источника азота, но и от общего состава среды. Существенное значение имеет соотношение в среде азота и углерода.

Таким образом, для нормального роста и развития микроорганиз­мов в питательной среде должны присутствовать все элементы, из которых формируется клетка.

Для получения продуктов микробиологического синтеза в зави­симости от микроорганизма-продуцента и технологии производства используют различные по составу среды. При этом помимо основных источников углерода, азота и минеральных веществ, микроорганиз­мы нуждаются в витаминах и микроэлементах. Поэтому в качестве добавки часто используются продукты естественного происхожде­ния, например, кукурузный и дрожжевой экстракт, молочную сыворотку, бульоны

Приготовление питательных сред осуществляется в специальных реакторах, оборудованных мешалками. В зависимости от растворимости и совместимости компонентов сред могут быть применены отдельные реакторы. Технология приготовления сред значительно усложняется, если в их состав входят нерастворимые компоненты. В различных биотехнологических процессах применяются различные по происхождению и количествам субстраты, поэтому процесс их приготовления варьирует. Поэтому дозирование питательных компонентов подбирается и осуществляется индивидуально на каждом производстве в соответствии с Технологическим регламентом конкретного процесса.

В качестве дозирующего оборудования при этом применяются весовые и объемные устройства, используемые в пищевой и химической промышленности. Транспорт веществ осуществляется насосами, ленточными и шнековыми транспортерами. Сыпучие компоненты подают в ферментеры с помощью вакуумных насосов. Часто применяют принцип предварительных смесей, то есть соли предварительно растворяют и затем транспортируют по трубопроводам, дозируя их подачу по объему. В силу исключительного разнообразия биотехнологических процессов и применяемых для их реализации сред, методов и аппаратуры рассмотрение данных элементов далее будет связано с конкретными биотехнологическими производствами.

Используемые в промышленности среды (как правило, жид­кие, комплексные, реже синтетические) стерилизуются тепло­вым методом (насыщенным паром).

Устойчивость микроорганизмов к тепловому воздействию опре­деляется многими факторами, в частности видовой принадлеж­ностью микроорганизма. Учитывается, что споры гораздо устой­чивее к нагреванию, чем вегетативные клетки. На эффективность тепловой стерилизации влияет количество клеток в среде: чем их меньше, тем легче достигается стерилизующий эффект. Из этого следует, что перед стерилизацией необходимо понижать количе­ство микробных клеток в среде.

Определяющее значение при тепловой стерилизации имеют температура и время ее поддержания. Чем выше температура, тем быстрее достигается стерилизующий эффект.

При тепловой стерилизации помимо гибели контаминирующих микроорганизмов могут разрушаться термолабильные вещества среды: витамины, ферменты, некоторые аминокислоты. С этим явлением, ухудшающим качество питательных сред, борются, повышая температуру и уменьшая время стерилизации.

Тепловая стерилизация жидкостей выполняется двумя спо­собами: периодическим и непрерывным. При периодическом способе стерилизация происходит в самом ферментере. Одно­временно нагревается весь объем жидкости (среды) до темпе­ратуры стерилизации, которая выдерживается определенное вре­мя, после чего понижается до заданной. Этот способ прост и применяется в случае небольших аппаратов. Его недостатки: значительный градиент температуры по объему и «недостери-лизация» в тупиках.

При непрерывном способе (более прогрес­сивном и производительном) стерилизация осуществляется в специальных установках.

В результате температуру можно увеличить до 130—150 °С; при этом время стерилизации уменьшается до 3—10 мин, что поло­жительно сказывается на качестве среды.

Недостатком в данном случае является увеличение протяжен­ности трубопроводов, что повышает вероятность вторичной кон­таминации.