Хроматография
.pdfМ И Н И СТ Е РСТ В О О БРА ЗО В А Н И Я И Н А У К И РО ССИ Й СК О Й Ф Е Д Е РА Ц И И
В О РО Н Е Ж СК И Й ГО СУ Д А РСТ В Е Н Н Ы Й У Н И В Е РСИ Т Е Т
Х рома т огра фи ч е ски е ме т оды в а на ли зе ле ка рст ве нны х и т окси ч ны х ве щ е ст в
П р акти кум д л я студ ентов по спец и ал ь ности
040500 – Ф ар м ац и я
В оронеж 2004
2
У тв ержд енонаучно-метод ическим советом фармацевтическогофакультета
(протокол№ 4 от6.04.2004.г.)
Составители: О .Ф .Стоя нова, И .В .Ш кутина, Н .Я .М окш ина, В .Ю .Х охлов , В .И .В асильева, В .Ф .Селеменев
П ред лагаемы й практикум д ает пред став ление об аналитической хроматографиисиспольз ов анием ее раз личны х вариантов как оцелостной
в ажной областикурса“ А налитическая химия ”. |
|
|
||
В практикуме из лагаются основ ы |
теории хроматографии, критерии |
|||
оценки качествараз д еления , описаны основ ны е уз лы |
хроматографических |
|||
приборов. П ред став лены |
практические работы |
по |
количественному |
|
опред елению в ещ еств |
в газ овой, |
жид костной |
и тонкослойной |
|
хроматографии. П ривед ены |
примеры обработкирез ультатов из мерений, их |
метрологическиехарактеристики. |
|
|
П рактикум |
пред наз начен д ля студ ентов , |
из учающ их курс |
“ А налитическая |
химия ” и специализ ирующ ихся в |
области химического |
анализ а. |
|
|
3
СО ДЕРЖ АНИ Е
I.ТЕО РЕТИ ЧЕС КИ Е ПРЕДС ТАВЛЕНИ Я В Х РО М АТО ГРАФ И И 4
К лассификация метод ов хроматографии… … … … … … … … … … … … … … .5 Способы получения хроматограмм … … … … … … … … … … … … … … … … ..6 В ы борвариантахроматографическогоанализ а… … … … … … … … … … … ..8 Х роматографическиепараметры … … … … … … … … … … … … … … … … ...10 Т еориихроматографическогораз д еления … … … … … … … … … … … … … .13 Селектив ностьираз реш ение… … … … … … … … … … … … … … … … … … ..14
II.О БРАБО ТКА Х РО М АТО ГРАФ И ЧЕС КИ Х ДАННЫ |
Х … … |
… |
… … |
..17 |
К ачественны й анализ … … … … … … … … … … … … … … … |
… … … |
… |
… … |
...17 |
К оличеств енны й анализ … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..18
III. ПРАКТИ ЧЕС КАЯ ЧАС ТЬ
ГАЗО АДС О РБЦ И О ННАЯ И ГАЗО Ж И ДКО С ТНАЯ Х РО М АТО ГРАФ И Я … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...22
Сорбенты иаппаратура… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 23 К ачественны й анализ … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...25 К оличеств енны й анализ … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .. 26 Л абораторная работа№ 1. О пред елениесод ержания спиртов в смеси метод ом газ ожид костной хроматографии… … … … … … … … … … … … … .27
Л абораторная работа№ 2. И д ентификация углекислоты в природ ном газ е и опред еление ееколичестваметод ом газ овой хроматографии… … … … … 31
И О НО О БМ ЕННАЯ Х РО М АТО ГРАФ И Я … … … … … … … … … … … … 32
Сорбенты … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ...32
Л абораторная работа№ |
1. О пред елениесод ержания сульфатанатрия … ..34 |
Л абораторная работа№ |
2. Раз д елениеионов цинкаиникеля на |
анионообменнике… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … .36
БУ М АЖ НАЯ И ТО НКО С ЛО Й НАЯ Х РО М АТО ГРАФ И Я … … … … 39
Н осители, растворители… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..39 К ачественны й анализ … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..40 К оличеств енны й анализ … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..41 Л абораторная работа№ 1. О пред елениепримесигид раз инав из ониаз ид е
(гид раз ид екислоты из оникотиновой) метод ом хроматографиив тонком |
|
слоесорбента(Т СХ ) … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … |
41 |
Л абораторная работа № 2. О пред еление концентрации ионов никеля |
в |
раствореметод ом бумажной хроматографии… … … … … … … … … … … … 45 Л абораторная работа № 3. К ачественное опред еление аминокислот в белковом гид ролиз атеметод ом бумажной хроматографии… … … … … … .46 Л абораторная работа № 4. К оличественное опред еление аспарагиновой, глутаминовой кислотив алинав белковом гид ролиз ате метод ом бумажной хроматографии… … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … ..48
Х РО М АТО ГРАФ И ЧЕС КИ Е М ЕТО ДЫ АНАЛИ ЗА В Ф АРМ АЦ И И И
Х И М И КО -Ф АРМ АЦ ЕВТИ ЧЕС КО Й ПРО М Ы Ш ЛЕННО С ТИ … .… ..50 ЗАДАЧИ ДЛЯ С АМ О КО НТРО ЛЯ … … … … … … … … … … … … … … … .55
ЛИ ТЕРАТУ РА … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … … 59
4
ТЕО РЕТИ ЧЕС КИ Е ПРЕДСТАВЛЕНИ Я В Х РО М АТО ГРАФ И И
Х роматография |
– наиболее |
часто использ уемы й |
аналитический |
|||||||
метод . |
Н овейш ими |
хроматографическими |
метод ами |
можно |
||||||
проанализ ировать |
газ ообраз ны е, |
жид кие |
и |
тверд ы е в ещ ества |
с |
|||||
молекуля рной массой от1д о106. Э томогутбы тьиз отопы |
вод ород а, ионы |
|||||||||
металлов , |
полимеры , |
белки, нефть и д р. |
С помощ ью |
хроматографии |
||||||
получена обш ирная |
информация остроении и свойствах многих классов |
|||||||||
органических соед инений. |
П рименение хроматографических метод ов д ля |
|||||||||
раз д еления |
белков |
оказ ало огромное в лия ние на раз в итие современной |
||||||||
биохимии. |
Х роматографию с успехом применя ют в исслед овательских и |
|||||||||
клинических целя х |
в |
самы х раз ны х областя х биологии и мед ицины , |
в |
|||||||
фармацевтике и криминалистике: |
д ля терапевтического мониторинга в |
|||||||||
свя з и с ростом нелегального употребления |
наркотиков, |
ид ентификации |
||||||||
антибиотиков и отнесения |
их к той или иной группе антибактериальны х |
препаратов, д ля анализ аотд ельны х наиболее важны х классов пестицид ов.
Т акие д остоинств а, |
как |
универсальность, |
э кспрессность и |
|
чувствительность д елают |
хроматографию в ажнейш им аналитическим |
|||
метод ом. |
|
|
|
|
Х роматографический |
метод анализ араз работан русским ботаником |
|||
.С. Ц ветом в 1903 г. В |
первы х же работах с помощ ью э тогометод а |
|||
М .С.Ц вет установ ил, |
что считавш ийся од нород ны м |
з елены й пигмент |
растений хлорофилл на самом д еле состоит из нескольких вещ еств . П ри
пропускании э кстракта |
з еленого листа через |
колонку, |
з аполненную |
|
порош ком мела, и промы вании |
петролейны м |
э фиром |
он получил |
|
несколько окраш енны х |
з он, что, |
несомненно, |
говорило о наличии в |
э кстракте нескольких в ещ еств. В послед ств ии э то бы ло под твержд ено д ругимиисслед ователя ми. Э тотметод онназ в алх рома т огра ф и е й (отгреч.
“ хроматос”– цв ет), хотя сам же указ ал на в оз можность раз д еления |
и |
|
бесцветны х в ещ еств. |
|
|
К омпоненты анализ ируемой смеси (сорбаты ) вместе с под в ижной |
||
фаз ой перед вигаются |
в д оль стационарной фаз ы . Е е обы чнопомещ ают в |
|
стекля нную или металлическую трубку, наз ы в аемую колонкой. |
В |
|
з ависимости от силы |
вз аимод ейств ия с поверхностью сорбента (з а счет |
ад сорбции или по какому-либо д ругомумеханиз му) компоненты буд ут
перемещ аться |
вд оль колонки с раз ной |
скоростью. |
О д ни компоненты |
||
останутся в |
в ерхнем слое сорбента, |
д ругие, |
в |
меньш ей |
степени |
в з аимод ействующ ие ссорбентом, окажутся в |
нижней части колонки, а |
некоторы е и вовсе покинут колонкувместе с под в ижной фаз ой, (такие
компоненты |
наз ы ваются не уде рж и ва е мы ми , а время их |
уд ерживания |
|
опред еля ет |
“ мертвое время ” |
колонки). Т аким образ ом, |
происход ит |
бы строе раз д еление сложны х |
смесей компонентов . П ри перемещ ении |
в д ольколонки под в ижная фаз ав стречаетнасвоем пути все нов ы е инов ы е слоисорбента, чтообеспечиваетмногократностьактов сорбции-д есорбции раз д еля емы х компонентов. Э тим обусловлена з начительно больш ая
|
|
5 |
|
|
э ффективность |
хроматографического раз д еления |
по сравнению |
со |
|
статическимиметод амисорбциииэ кстракции. |
|
|
||
|
Хрома т огра ф и я – э то физ ико-химический |
метод раз д еления |
и |
|
опред еления вещ еств, основанны й на распред елении компонентов межд у |
||||
д вумя |
фаз ами, |
непод в ижной и под в ижной. Н епод вижной (стационарной) |
||
фаз ой |
служит тверд ое пористое вещ еств о или пленка в ы сококипя щ ей |
органической жид кости, нанесенная натверд ое вещ ество. П од вижная фаз а пред ставля ет собой жид кость или газ , протекающ ий через непод в ижную
фаз у. |
|
|
|
|
|
Хрома т огра ф и я – э тод инамический процесс. М |
ногократностьактов |
||||
сорбции – д есорбции раз д еля емы х компонентов |
обеспечивает больш ую |
||||
э ффективность хроматографического |
раз д еления |
по сравнению со |
|||
статическимиметод амисорбциииэ кстракции. |
|
|
|
||
Хрома т огра ф и я |
– гибрид ны й |
метод |
анализ а, |
в котором |
|
хроматографический |
процесс я вля ется |
частью |
общ ей |
аналитической |
системы , сочетающ ей раз д еление ииз мерение. М етод поз в оля етне только раз д еля тьмногокомпонентную смесь, но ид ентифицироватьи опред еля ть ееколичественны й состав.
Кла сси фи ка ц и я ме тодов хрома тогра фи и
Раз личны е метод ы хроматографии можно классифицировать по агрегатному состоя нию фаз , способу их относительного перемещ ения , аппаратурномуоформлению процессаи т. д . По а гре га т ному сост оя ни ю фаз хроматографические метод ы обы чно классифицируют след ующ им образ ом (табл.1):
|
|
|
Т аблица1 |
|
Н епод вижная |
П од в ижная |
фаз а |
|
|
фаз а |
|
|
|
|
Газ ообраз ная |
Ж ид кая |
|||
|
||||
|
|
|
||
|
Газ о-ад сорбционная |
Ж ид костно-ад сорбционная |
||
Т верд ая |
хроматография |
колоночная |
|
|
|
|
И оннообменная |
||
|
|
О сад очная |
|
|
|
Распред елительная |
Распред елительная |
||
Ж ид кая |
газ о- жид костная |
жид костьжид костная |
||
|
хроматография |
хроматография |
||
|
|
|
|
|
По ме х а ни зму вза и модейст ви я сорбе нт а и сорба т а |
можновы д елить |
|||
нескольков ид ов хроматографии: |
|
|
||
– ад сорбционная хроматография |
основана |
на раз личии в |
ад сорбируемостивещ еств тверд ы м сорбентом;
6
– распред елительная хроматография – нараз личиив растворимости раз д еля емы х вещ еств в непод в ижной фаз е (газ овая хроматография ) илина раз личии в растворимости в ещ еств в под в ижной и непод вижной жид ких фаз ах;
–ионообменная хроматография – нараз ной способностивещ еств к ионномуобмену;
–э ксклюз ионная хроматография – нараз личиив раз мерах иформах молекулраз д еля емы х вещ еств ;
–аффинная хроматография – на специфических вз аимод ейств ия х, характерны х д ля некоторы х биологических ибиохимических процессов.
По т е х ни ке вы полне ни я раз личают |
|
|
||||
– |
колоночную |
хроматографию |
(раз д еление провод ится |
в |
||
специальны х колонках); |
|
|
|
|
||
– |
плоскостную |
хроматографию, |
когд а раз д еление провод ится на |
|||
специальной бумаге |
(бумажная хроматография ) |
или в тонком |
слое |
|||
сорбента(тонкослойная хроматография ). |
|
|
|
|||
По це ли х рома т огра ф |
и рова ни я вы д еля ют |
|
|
|||
– |
аналитическую хроматографию (качеств енны й иколичеств енны й |
|||||
анализ ); |
|
|
|
|
|
|
– |
препаративную хроматографию (д ля получения вещ еств в чистом |
|||||
в ид е, д ля концентриров ания ив ы д еления микропримесей); |
|
|||||
– |
промы ш ленную |
(произ вод ственную) |
хроматографию |
д ля |
||
автоматическогоуправления процессом. |
|
|
|
По способу от носи т е льного пе ре ме щ е ни я ф а зраз личают
–фронтальную;
–проя в ительную, илиэ люентную;
–вы теснительную хроматографию.
В хроматографии под в ижную фаз у, |
в вод имую в слой непод в ижной |
||||||
фаз ы , наз ы вают элюе нт ом, |
апод в ижную |
фаз у, вы ш ед ш ую из колонки и |
|||||
сод ержащ ую раз д еленны екомпоненты , – элюа т ом. |
|
|
|||||
С п особ ы |
п олуч е ни я хрома тогра мм |
|
|
||||
Ф ронт а льны й ме т од |
|
|
|
|
|
|
|
Э топростейш ий пометод ике вариантхроматографии. |
О н состоитв |
||||||
том, что через |
колонку |
с ад сорбентом |
непреры в но |
пропускают |
|||
анализ ируемую смесь, например, компонентов |
А и В |
в растворителе. |
|||||
В след ств ие сорбции в ещ еств |
А и В |
сначала из колонки буд етв ы текать |
|||||
растворитель Solv, |
з атем |
раств оритель и менее |
сорбирующ ийся |
||||
компонент А , а з атем и компонент В |
и, таким образ ом, |
через некоторое |
в ремя состав растворапри прохожд ениичерез колонкуменя ться не буд ет. В раств оре, вы текающ ем из колонки, опред еля ют концентрацию кажд ого
компонента и строя т график в коорд инатах |
концентрация вещ ества – |
объем раствора, прош ед ш егочерез колонку. |
Э туз ав исимость наз ы в ают |
х рома т огра ммой иливы х одной кри вой (рис1). |
|
7
С
S+A+B
S+A
S
V
Рис.1. В ы ход ная кривая фронтальногоанализ а.
П рифронтальном способе получения хроматограммы в чистом вид е можно вы д елить лиш ь од но вещ еств о, поэ тому фронтальны й метод использ уется срав нительноред ко. Д анны й метод применя ется , например, д ля очистки раствора от примесей, если они сорбируются з начительно
лучш е, чем основной компонент, или д ля |
в ы д еления |
из |
смеси наиболее |
|
слабосорбирующ егося вещ еств а. |
|
|
|
|
Прояви т е льны й (элюе нт ны й) ме т од |
|
|
|
|
П ри работе по э тому метод у |
в |
колонку |
в вод я т порцию |
|
анализ ируемой смеси, сод ержащ ей компоненты |
А и В |
в растворителе Solv, |
||
и колонку непреры в но промы вают газ ом-носителем |
или растворителем |
Solv. П ри э том компоненты анализ ируемой смеси раз д еля ются на з оны :
хорош осорбирующ ееся |
в ещ ествоВ з анимает верхнюю часть колонки, а |
менее сорбирующ ийся |
компонент А буд ет з анимать нижнюю часть. |
Т ипичная в ы ход ная крив ая из ображенанарис.2.
С B
V
Рис.2. В ы ход ная кривая э люентногоанализ а.
8
В газ е или раств оре, в ы текающ ем из колонки, сначала поя в ля ется компонент В , д алее – чисты й растворитель, а з атем компонент А . Чем больш е концентрация компонента, тем вы ш е пик и больш е егоплощ ад ь, что составля ет основу количественного хроматографического анализ а. П роя в ительны й метод д ает воз можность раз д еля ть сложны е смеси, он наиболее частоприменя ется на практике. Н ед остатком метод а я в ля ется
уменьш ение концентрации вы ход я щ их |
раств оров з а счет раз бавления |
|
растворителем (газ ом – носителем). |
|
|
Вы т е сни т е льны й |
ме т од |
|
В э том метод е |
анализ ируемую |
смесь компонентов А и В в |
растворителе Solv в вод я т в колонкуи промы ваютраствором в ещ ества С (вы теснитель), облад ающ им больш ей сорбируемостью, чем любое из раз д еля емы х в ещ еств . П омере прод вижения поколонкеэ люентв ы тесня ет в ещ ествоС, которое в свою очеред ьвы тесня етвещ ествоВ , и т.д . К ажд ы й из компонентов вы д еля ется в чистом в ид е, ноне количественно, так как з оны компонентов нераз д елены промежуткамичистогосорбента(рис.3).
С
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
С |
|
|
|
|
|
|
|
В |
|
|
|
|
|
В |
А |
+ |
|
|
|
|
|
||||||
|
|
|
|
|
|
А |
|
|
|
|
|
А |
V
Рис.3. В ы ход ная кривая в ы теснительногоанализ а.
К онцентрация раствораприхроматографированиине уменьш ается в отличие от проя в ительногометод а. О д нако сущ ественны м нед остатком в ы теснительногометод ая вля ется частое наложение з оны од ноговещ еств а наз онуд ругого, посколькуз оны компонентов в э том метод е не разд елены з оной раств орителя .
Вы б ор ва ри а нта |
хрома тогра фи ч е ского а на ли за |
Д ля провед ения |
хроматографическогоанализ а обы чноиспольз уют |
след ующ ую метод ику: в ы бираютнужны е под в ижны е инепод вижны ефаз ы в з ав исимости от свойств анализ ируемы х в ещ еств, т.е. в ы бирают
опред еленны й |
вариант хроматографии (рис.4), |
устанавлив ают |
необход имы й |
режим хроматографа (температуру, |
скорость под ачи |
|
9 |
|
|
под вижной |
фаз ы , д етектор), з атем |
пров од я т |
хроматографическое |
раз д еление |
и регистрируют сигнал. |
И спольз уя |
полученны й сигнал, |
опред еля ют сод ержание кажд огокомпонента в под в ижной фаз е после ее в ы ход аиз колонки.
Рис.4 Схемав ы боравариантахроматографическогоанализ а.
|
|
10 |
|
|
|
Х рома тогра фи ч е ски е |
п а ра ме т ры |
|
|
Н аиболее |
важны ми |
хроматографическими |
параметрами, |
поз воля ющ имиоценитьэ ффективностьиселективностьколонкиистепень раз д еления раз личны х в ещ еств, я вля ются : время уд ержив ания , уд ерживаемы й объем, коэ ффициент емкости, коэ ффициент уд ержив ания ,
число теоретических тарелок, |
в ы сота, э кв ивалентная теоретической |
|
тарелке, коэ ффициентселективностиикоэ ффициентраз д еления . |
||
Н а рис.5 пред ставлена ид еализ ированная |
хроматограмма смеси |
|
д вух вещ еств . П о оси абсцисс отложено время |
хроматографирования |
|
(можноотложитьобъем э люата), |
пооси орд инат– аналитический сигнал, |
свя з анны й с концентрацией вещ еств в э люате (отклик А ). Рассмотрим основны е хроматографические параметры , характериз ующ ие повед ение в ещ ества в колонке. В ремя от момента в вод а анализ ируемой пробы д о момента регистрации максимума пика наз ы в ают вре ме не м уде рж и ва ни я , иливр е ме не м элюи рова ни я - (tR). В ремя уд ерживания склад ы в ается из д в ух состав ля ющ их – времени пребы в ания в ещ еств в под в ижной фаз е (tm) и в ременипребы вания в непод в ижной фаз е(tS) :
tR = tm+ tS |
(1) |
Значение tm |
фактически рав но прохожд ения через колонку |
несорбируемогокомпонента. Значение tR не з ав иситотколичествапробы ,
ноз ав иситотприрод ы |
вещ естваисорбентаиможетменя ться отколонкик |
колонке. П оэ тому |
д ля характеристики истинной уд ерживающ ей |
способностислед уетв вестии спра вле нное вре мя уде рж и ва ни я ( tR' ) : |
|
tR' = tR - tm |
(2) |
A |
tR2 |
tR1
tm tR′
w=4σ |
В ремя |
Рис.5. Х роматограммасмесид вух вещ еств.