62. Диагностические сыворотки, получение и использование.

Диагностические иммунные сыворотки широко применяются для определения вида или типа микроба, выделенного от больного или носителя и для определения природы неизвестного белка при условии, если его можно получить в коллоидном состоянии. В зависимости от характера антигена, послужившего для иммунизации животного, сыворотка последнего приобретает различные свойства. Специфические свойства иммунных сывороток могут быть обнаружены путем изучения действия их на соответствующие антигены. В зависимости от условий опыта у таких сывороток можно наблюдать агглютинирующее (склеивающее), преципитирующее (осаждающее) и литическое (растворяющее) действие. Применительно к наблюдаемым феноменам принято говорить о соответствующих иммунных телах, содержащихся в сыворотках: агглютининах, преципитинах, лизинах и пр. Агглютинирующие сыворотки При идентификации микробов, наряду с определением морфологических, культуральных и биохимических свойств их, широко используются диагностические агглютинирующие сыворотки. Агглютинацией называется склеивание микробов, скучивание их под влиянием специфических антител - агглютининов, содержащихся в иммунной сыворотке. Реакция агглютинации в настоящее время является наиболее часто применяемой, нередко единственной в смысле определения и выделения различных видов из группы морфологически неотличимых бактерий. Групповая агглютинация затрудняет определение вида выделенного микроба и серологическую диагностику заболевания. Устранить групповую агглютинацию можно, удалив из сыворотки антитела в отношении антигенов, являющихся общими для гомологичного микроба и для родственных с ним. Это достигается путем смешения небольшого количества сыворотки с густой взвесью микробов, дающих групповую агглютинацию, что ведет к адсорбции на их поверхности соответствующих антител. В жидкости, полученной после центрифугирования, остаются антитела лишь в отношении гомологичного микроба.  Антитела, обусловливающие агглютинацию бактерий и иных клеток, получили название агглютининов, а сыворотки, содержащие эти антитела, агглютинирующих. Сыворотки получаются путем иммунизации животных соответствующими микробами. В качестве продуцентов агглютинирующих сывороток могут быть использованы кролики, бараны, козы, ослы и лошади. Наиболее свободными от неспецифических антител являются сыворотки кроликов. Для иммунизации животных можно применять живые и убитые культуры, являющиеся типичными по своим морфологическим, культуральным, биохимическим, серологическим и антигенным свойствам. Лучшие результаты получаются при применении формалинизированных и обработанных парами формалина микробных взвесей. Иммунизацию проводят путем введения антигена в краевую ушную вену, начиная с 500 млн. микробных тел в 1 мл и увеличивая дозу вдвое при последующих введениях. Для получения полноценных сывороток обычно бывает достаточно 3-4 инъекций с интервалами в 5 дней. На 5-7 день после третьей иммунизации берется проба крови и проверяется титр сыворотки. Титром сыворотки считается то наибольшее ее разведение, с которым получается реакция агглютинации соответствующей культуры, оцениваемая тремя крестами при помощи агглютиноскопа. Если титр сыворотки оказывается достаточным, то в тот же день у кролика производится кровопускание. Кровь можно получить тремя способами:  1) из ушной вены;  2) из сердца; 3) из сонной артерии (тотальное кровопускание). Кровь по каплям собирается в большую стерильную пробирку. Полученная кровь ставится на 10-15 минут в термостат, образовавшийся сгусток отделяется от стенок пробирки, после чего кровь выдерживается в течение 24-48 часов в рефрижераторе при температуре 4-8 °С. В настоящее время от крупных животных (лошади, ослы и др.) кровь берут в бутыли с цитратным раствором. Плазму дефибринируют раствором хлористого кальция. К полученной сыворотке добавляется консервант. Сыворотка (в нативном виде) выдерживается не менее 1 месяца при температуре 4-8 °С для стабилизации титра, после чего определяется окончательный титр ее к гомологичным штаммам и наличие групповой реакции путем постановки реакции агглютинации с набором соответствующих живых культур в количестве 3-5 штаммов каждого вида. Титр групповых агглютининов не должен превышать 1/8 титра к гомологичным культурам. Институтами вакцин и сывороток выпускаются неадсорбированные и адсорбированные агглютинирующие сыворотки. Специфические адсорбированные агглютинирующие сыворотки получают путем удаления методом адсорбции неспецифических и групповых антител из нативных сывороток. Использование адсорбированных сывороток дает возможность определения выделенного микроба в пределах вида или типа при помощи реакции агглютинации на стекле без дополнительной постановки развернутой агглютинации. Для адсорбции агглютинирующих сывороток в качестве адсорбента могут применяться живые и убитые бактерии. Наилучшей адсорбционной способностью обладает живая культура, содержащая все антигенные компоненты в неизмененном виде. Полученные микробные взвеси перед употреблением центрифугируются в необходимом количестве и добавляются к адсорбируемой сыворотке. Адсорбцию сывороток следует начинать адсорбентами, имеющими близкое родство с культурой, примененной для получения данной сыворотки. Сыворотка с адсорбентом помещается в термостат при 37 °С на срок от 2 до 18 часов и затем в рефрижератор до следующего дня. Истощаемая сыворотка после каждой адсорбции проверяется в реакции агглютинации на стекле как с культурами того вида, которыми ведется истощение, так и с культурами, реагировавшими с ней при первоначальном контроле, а также с гомологичными культурами. Полностью адсорбированные сыворотки освобождаются от микробных тел путем центрифугирования или сепарирования. Если к нативной сыворотке не добавлялся консервант, то к полученной серии сыворотки следует добавить 1-2 % перекристаллизованной борной кислоты. Затем сыворотка фильтруется через стерилизующий бактериальный фильтр и после выдерживания в течение 2-х суток при комнатной температуре испытывается на стерильность, специфичность и высоту титра. Контроль на специфичность адсорбированных агглютинирующих сывороток проводится до и после фильтрования - реакцией агглютинации на стекле и развернутой реакцией агглютинации с гомологичными и гетерологичными культурами. Ясно выраженная положительная реакция агглютинации, получаемая с 3-5 гомологичными культурами в течение 1 минуты при комнатной температуре, при отсутствии реакции агглютинации с культурами других серологических типов в течение 20 минут служит критерием для выпуска адсорбированных сывороток. Диагностические агглютинирующие сыворотки разливаются по 1 мл в соответствующие ампулы, которые упаковываются по нескольку штук (не более 10) в коробку. Агглютинирующие сыворотки необходимо хранить в темном сухом месте при 4-10 °С. При правильном содержании сыворотка сохраняет свою активность в течение одного года со дня изготовления. Агглютинирующие адсорбированные сыворотки выпускаются и в сухом виде. Сыворотки перед высушиванием в стерильных условиях разводят сахарозо-желатиновой средой, разливают по 1 мл в стерильные ампулы и высушивают из замороженного состояния в условиях глубокого вакуума. Преципитирующие сыворотки Преципитирующие сыворотки применяются для постановки реакций преципитации с целями диагностики некоторых инфекционных заболеваний, для определения природы неизвестного белка при условии, если его можно получить в коллоидном состоянии, в судебно-медицинской практике для распознавания видовой принадлежности крови, в санитарии, химии и т.д. Реакция преципитации характеризуется чрезвычайно высокой чувствительностью и специфичностью. Она позволяет обнаружить ничтожные следы антигена (до разведения 1:100000 и выше). Действие преципитирующих сывороток на антиген сходно с действием агглютинирующих. Преципитирующие сыворотки получаются путем искусственной иммунизации животного живыми или убитыми микробами, а также разнообразными лизатами и экстрактами микробных клеток. Наилучшие преципитирующие сыворотки получаются при иммунизации полным антигеном или соляно-кислой вакциной. Применяемую для иммунизации животных экстрагированную соляно-кислую вакцину готовят следующим образом: густой смыв суточной культуры дважды промывают (при центрифугировании) физиологическим раствором и обрабатывают десятикратным количеством 0,2 N соляной кислоты в течение 18-24 часов при температуре 37 °С. Затем центрифугируют, полученный осадок микробных тел дважды промывают физиологическим раствором и нейтрализуют 25 % раствором углекислой соды. Полученную вакцину оставляют в виде осадка. Преципитирующие сыворотки готовятся подобно агглютинирующим, только выпускаются они с высокими титрами, не ниже 1:100000, что достигается более длительной иммунизацией животных. Небольшие дозы (0,5 мл) антигена вводятся в течение 2-3 недель по 3 дня подряд с перерывом в 4 дня. Более массивные дозы (1-2-3 мл) вводятся с интервалами в 4-6 дней по 8-12-16 раз. Значительной эффективностью обладает разделение иммунизации на несколько циклов, из которых один производится внутривенно (6-8 инъекций по 1-2 мл), а другой - крупными дозами внутрибрюшинно (6-8 инъекций по 3-5 мл). Кровопускание производится на 8-12-й день после последнего введения антигена. Полученная сыворотка консервируется добавлением 1-2 % сухой борной кислоты или 0,5 % хлороформа. Готовый препарат контролируют на специфичность, стерильность и высоту титра. При титровании преципитирующей сыворотки определяется то предельное разведение антигена, которое может быть обнаружено при помощи цельной или разведенной иммунной сыворотки. 62.Живые вакцины, получение и применение, достоинства и недостатки.

Живые аттенуированные вакцины конструируются на основе ослабленных штаммов микроорганизмов, потерявших вирулентность, но сохранивших антигенные свойства. Такие штаммы получают методами селекции или генетической инженерии. Живые вакцины при введении в организм приживляются, размножаются, вызывают генерализованный вакцинальный процесс и формирование специфического иммунитета к патогенному микроорганизму, из которого получен аттенуированный штамм. Получают живые вакцины путем выращивания аттенуированных штаммов на питательных средах, оптимальных для данного микроорганизма. Бактериальные штаммы культивируют или в ферментерах на жидких питательных средах, или на твердых питательных средах; вирусные штаммы культивируют в куриных эмбрионах, первично-трипсинизированных, перевиваемых культурах клеток. Процесс ведут в асептических условиях. Биомассу аттенуированного штамма подвергают концентрированию, высушиванию со стабилизирующей средой, затем ее стандартизируют по числу микроорганизмов и фасуют в ампулы или флаконы. Консервант к живой вакцине не добавляют. Срок годности вакцины ограничен 1.2 годами, вакцина должна храниться и транспортироваться при пониженной температуре (от 4 до 8 .С). Живые вакцины применяют, как правило, однократно; вводят их подкожно, накожно или внутримышечно, а некоторые вакцины . перорально (полиомиелит) и ингаляционно. Живые вакцины составляют примерно половину всех применяемых в практике вакцин. Наиболее важные для иммунопрофилактики живые вакцины приведены ниже. Бактериальные живые вакцины: туберкулезная (из штамма БЦЖ); чумная (из штамма EV); туляремий-ная, сибиреязвенная (из штамма СТИ-1); бруцеллезная (из штамма 19-ВА); против Ку-лихорадки. Вирусные живые вакцины: оспенная (на основе вируса оспы коров); коревая (из штамма Л-16 и штамма Эдмонстон); полиомиелитная (из штаммов А. Сэбина типов 1, 2, 3); против желтой лихорадки (из штамма 17D); гриппозная (из лабораторных штаммов); против венесуэльского энцефаломиелита лошадей (из штамма 230); паротитная

Положительные стороны: по механизму действия  на  организм  напоминают

"дикий"  штамм,  может  приживляться  в  организме  и  длительно   сохранять

иммунитет (для коревой  вакцины  вакцинация в 12 мес.  и  ревакцинация  в  6

лет), вытесняя "дикий" штамм. Используются  небольшие  дозы  для  вакцинации

(обычно однократная) и поэтому вакцинацию  легко  проводить  организационно.

Последнее  позволяет  рекомендовать  данный  тип   вакцин   для  дальнейшего

использования.

   Отрицательные стороны: живая  вакцина  корпускулярная -  содержит  99%

балласта и поэтому обычно достаточно реактогенная, кроме того, она  способна

вызывать мутации клеток  организма  (хромосомные  аберрации),  что  особенно

опасно  в  отношении  половых  клеток.  Живые   вакцины   содержат   вирусы-

загрязнители (контаминанты), особенно это  опасно  в  отношении  обезьяннего

СПИДа и онковирусов.  К  сожалению,  живые   вакцины   трудно  дозируются  и

поддаются биоконтролю, легко чувствительны к действию высоких  температур  и

требуют неукоснительного соблюдения холодовой цепи.

  Хотя  живые   вакцины  требуют  специальных  условий  хранения,  они

продуцируют достаточно  эффективный  клеточный  и  гуморальный  иммунитет  и

обычно требуют лишь  одно  бустерное  введение.  Большинство  живых   вакцин

вводится парентерально (за исключением полиомиелитной  вакцины).

 

      На фоне преимуществ живых  вакцин  имеется и одно  предостережение,  а

именно: возможность реверсии вирулентных  форм,  что  может  стать  причиной

заболевания вакцинируемого. По  этой  причине  живые   вакцины  должны  быть

тщательно   протестированы.   Пациенты   с   иммунодефицитами    (получающие

иммуносупрессивную терапию, при СПИДе и опухолях) не должны  получать  такие  вакцины.