В.Определение активности каталазы газометрическим методом.

Об активности каталазы можно судить по объему кислорода, выделившегося в результате разложения перекиси водорода. Работу проводят на газометрической установке в специальных пробирках-каталазниках.

Ход работы

Навеску растительного материала (0,5 г) растирают в ступке в 5 мл дистиллированной воды, добавляя немного мела для создания щелочной реакции. Экстракт, используя стеклянную палочку,осторожно переносят в одно колено каталазника. В другое колено помещают 5 мл 3% перекиси водорода. Затем, не допуская перемешивания содержимого каталазника, его соединяют каучуковой трубкой с газоизмерительной установкой (рис.5), показания которой выставлены на «0», а зажим закрыт.

Открывают зажим, быстрым изменением положения каталазника смешивают содержимое в обоих коленах и замечают начало экспозиции.

Аккуратно покачивая каталазник, определяют объем выделившегося кислорода по понижению уровня жидкости в бюретке. Рекомендуемая экспозиция: 1-3 мин.

Во время опыта нельзя держать каталазник плотно всей ладонью, так как при нагревании воздух в нем расширится, что может повлиять на точность результатов. По окончании опыта зажим открывают и отсоединяют каталазник.

Активность каталазы пересчитывают в млО₂/г сырого веса. Делают вывод об активности фермента в разных органах растения, растениях разного возраста и систематического положения.

Материалы и оборудование:

1. Клубни картофеля – свежий и вареный

2. Побеги различных растений, листья элодеи

3. 1%-ный спиртовой раствор гваяколовой смолы (1г гваяколовой смолы растворить при нагревании в водяной бане в 70 мл этилового спирта, профильтровать и добавить 30 мл дистиллированной воды. Хранить в плотно закрытой посуде в холодильнике)

4. 3%-ный раствор Н₂О₂

5. Скальпели;

6. Ножницы

7. Микроскопы

8. Стекло

9. Стаканы с водой

10. Фильтровальная бумага.

11. Технические весы с разновесами

12. Ступки с пестиками

13. Мел в порошке

14. Каталазники

15. Пипетки на 5 мл

16.Газометрическая установка для определения активности каталазы, заполненная подкрашенной жидкостью

17.Секундомер или часы

Работа 10. Определение интенсивности дыхания растений по поглощению кислорода манометрическим методом Варбурга

Манометрические методы широко применяются при исследовании любых процессов, протекающих с выделением или поглощением газов. Преимуществом этих методов является большая чувствительность, незначительный расход опытного материала; возможность, не прерывая опыта (путём ряда отсчётов), изучать динамику процесса.

Манометрический метод, разработанный О. Г. Варбургом для оценки интенсивности дыхания, основан на определении количества выделенного СО₂ или поглощённого объектом О₂ по изменению давления в замкнутой системе при постоянном объёме и температуре. Давление измеряется с помощью чувствительного манометра. Манометр состоит из U-образной капиллярной трубки, заполненной специальной, не смачивающей стенки манометра жидкостью (рис.5).

З

7

амкнутым пространством служат опытные сосудики, присоединённые посредством шлифа к правой ветви манометра. Объём замкнутого пространства, таким образом, складывается из объёма сосудика и прилегающей части манометра (объёма капилляра до уровня в нём манометрической жидкости).Постоянство объёма системы достигается тем, что пред началом измерений и каждым последующим отсчётом мениск манометрической жидкости в соединённой с сосудиком правой ветви манометра подводят к условно выбранному одному и тому же значению (150 мм). Об изменении давления газа в системе судят по уровню манометрической жидкости в левой (открытой) ветви манометра.

Основным условием использования этого метода для изучения газообмена при дыхании, где участвуют два газа, является регистрация изменений в давлении одного газа. Так, если дыхание оценивается по интенсивности поглощения О₂, изменение парциального давления другого газа (СО₂) искусственно должно быть приведено к нулю. Последнее достигается введением в замкнутую систему (в боковой отросток или центральный цилиндр сосудика) раствора КОН. Раствор КОН поглощает выделяющуюся углекислоту.

Устройство аппарата Варбурга

Прибор Варбурга состоит из термостатической цилиндрической ванны объёмом 30-35л. Прибор снабжён двумя двигателями, один служит для перемешивания воды (мешалка), второй приводит в движение механизм, обеспечивающий качания манометров. Амплитуда колебаний может меняться. Прибор оснащён 16 манометрами. Конструкция прибора позволяет приближать к экспериментатору любой манометр. Постоянная температура воды в ванне поддерживается с помощью термостата, который включен в сеть через контактный термометр (колебания температуры не должны превышать ±0,02⁰С).

Основной частью прибора является реакционный сосудик, соединённый с манометром. Конструкция сосудиков может быть самой разнообразной. Наиболее часто при определении поглощения О₂ используют сосудики с одним боковым отростком. Этот отросток позволяет вводить в систему тот или иной реагент (например, в него вносится щёлочь для поглощения СО₂). Боковой отросток сосудика закрывается пробкой, которая притирается вращательными движениями; таким же образом сосудики притираются к манометрам.

Манометры изготовляются из толстостенных стеклянных трубок, внутренний диаметр которых равен 0,8-1,0 мм. Форма манометра – U-образная. Обе ветви манометра имеют шкалу с разметкой делений снизу вверх от 0 до 300 мм. Левая ветвь заканчивается небольшим всегда открытым расширением; правая – имеет боковой отросток, выше которого расположен трёхходовой кран (закрыт во время опыта). Боковой отросток заканчивается шлифом, к нему притирается сосудик. Ветви манометра внизу сходятся и соединяются у основания с резервуаром с манометрической жидкостью. Специальным винтовым зажимом, позволяющим сжимать резиновый резервуар, уровень жидкости в манометре может быть легко изменён.

В качестве манометрической жидкости используют следующие растворы:

1. 25 г NаСl, 5 г холеиновокислого натрия растворяют в 500 мл воды (плотность раствора 1,033 г*см^-3). Полученный раствор рекомендуется подкрасить флуоресцином. Несколько капель спиртового раствора тимола добавляют в качестве антисептика.

2. 11,5 г NаСl растворяют в 100 мл воды, добавляют 0,25 г додецилсулфата натрия и после внесения флуоресцина и тимола объём раствора доводят до 250 мл (плотность раствора 1,033 г*см^-3).

Ход работы

1. В боковой отросток чистого сухо сосудика наливают 0,2 мл 20% раствора КОН. Для увеличения поверхности, поглощающей СО₂, в боковой отросток пинцетом опускают квадратик фильтровальной бумаги, сложенной несколько раз в виде гармошки. Боковой отросток закрывают пробкой (шлифы пробки и сосудика обязательно притираются).

2. В основное пространство сосудика помещают растительный объект: 0,3-0,5 г разрезанных на кусочки листьев; при работе с корневыми системами или водными растениями их после взвешивания помещают в жидкость (воду или питательный раствор).

3. Опытный сосудик соединяют с манометром, шлиф которого предварительно должен быть смазан вазелином. Прозрачность шлифа является показателем того, что он хорошо притёрт. На выступы сосудика и манометра надевают резиновые кольца, поддерживающие сосудик.

4. Оставляя краны открытыми, манометры закрепляют в соответствующих «гнёздах» на внешней стороне термостата; сосудики должны быть полностью погружены в воду (вода в термостатной ванне прогревается заранее до 27⁰С).

5. Одновременно с опытными сосудиками помещают в ванну термостата термобарометры. Термобарометр представляет собой манометр, полностью идентичный опытному, за исключением того, что растительный объект в сосудике заменён равным объёмом воды. Любые изменения в уровне манометрической жидкости этого манометра, вызванные изменением температуры водяной бани или барометрического давления, могут быть использованы для коррекции показаний опытных манометров.

6. Включают качающий механизм; 10-20 мин манометры и сосудики качаются – этим достигается выравнивание температуры в сосудиках и термостатируемой ванне.

7. По достижению прогрева, необходимо остановить качание и с помощью винтового зажима уровень манометрической жидкости в правой (соединённой с сосудиком) ветви манометра установить на делении 150 мм. Закрыть трёхходовой кран, отметить исходное (нулевое) положение мениска манометрической жидкости в левой ветви манометра (записать это первое показание, Н₁), возобновить качание и зафиксировать время начала опыта (т. е. учёта интенсивности поглощения О₂).

8. В зависимости от величины взятой навески и интенсивности дыхания объекта, отсчёты по показаниям манометра следует снимать через временной интервал 10-20 мин и более. Для снятия отсчёта отключают систему качания, уровень жидкости в правой ветви манометра снова доводят до деления 150 мм (это гарантирует постоянство объёма) и записывают уровень мениска в левой ветви манометра (Н₂).

9. Учитывая первое (нулевое) и второе показания опытного манометра и термобарометра, определяют величину смещения уровня манометрической жидкости за время опыта. Полученную разницу, выраженную в мм столба манометрической жидкости, умножают на константу сосудика. Константа характеризует объём газа (мкл), который вызывает смещение жидкости в манометре на 1мм. Величина константы зависит от объёма сосудика, прилегающей к нему части манометра, объёма помещаемой в сосудик реакционной смеси и определяется до начала проведения экспериментов. Константы сосудиков, применяемых в настоящем исследовании: 0,95-1,10 мкл/мм

Окончательная формула для расчёта количества поглощённого кислорода на единицу массы в единицу времени с учётом показаний термобарометра:

мкл О₂*ч^-1*г^-1, где:

Н₁-Н^*₂, изменение давления газа в опытном сосудике в мм манометрической жидкости

(*При определении дыхания происходит поглощение О₂ из замкнутого газового пространства, поэтому показания опытных манометров падают).

H’₁-H’_2, изменение давления газа в термобарометре, мм

Р – навеска (г)

t – время (мин)

K_t – константа сосудика термобарометра, К₀ – опытного сосудика, мкл/мм.

Результаты опыта записывают в таблицу и делают вывод об интенсивности дыхания растительных объектов разного систематического положения и возраста.

Материалы и оборудование:

1. Прорастающие семена, распускающиеся почки, проростки разного возраста (горох, пшеница, сирень и др. растения)

2. Раствор КОН (20%)

3. Квадратики фильтровальной бумаги (2х2 см)

4. Пинцет

5. Вазелин

6. Микропипетки

7. Ножницы

8. Резиновые кольца

9. Весы, разновесы

10. Прибор Варбурга (включая сосудики и манометры)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Баславская С.С., Трубецкова О.М. Практикум по физиологии растений. М.:Изд-во МГУ, 1964. – 328с.

2. Викторов Д.П. Малый практикум по физиологии растений. – М.:Изд-во «Высшая школа», 1969. – 120с.

3. Викторов Д.П. Практикум по физиологии растений. – Воронеж: изд-во Воронежского ун-та, 1991. – 158с.

4. Полевой В.В. Физиология растений. – М.:Изд-во «Высшая школа», 1989. – 464с.

5. Практикум по физиологии растений. – М., Изд-во «Колос», 1972. – 179с.

6. Практикум по физиологии растений /И.В. Плотникова и др.; Под ред. В.Б. Иванова – М.: Изд-во «Академия», 2001. – 144с.

7. Физиология растений /Н. Алехина и др. Под ред. И.П. Ермакова. – М.: Изд-во «Академия», 2005. – 640с.

Юлия Витальевна Синицына, Любовь Николаевна Олюнина,

Елена Олеговна Половинкина