А. Разделение пигментов по Краусу.

Метод основан на различной растворимости пигментов в спирте и гептане (бензине). Эти растворители при сливании не смешиваются и образуют две фазы: верхнюю – гептановую (бензиновую), нижнюю – спиртовую, поэтому и происходит разделение компонентов смеси.

Ход определения.

В пробирку наливают 2 – 3 мл спиртовой вытяжки и добавляют 3 – 4 мл гептана (бензина). Содержимое пробирки встряхивают и дают отстояться. При этом происходит разделение слоев:

верхний– зеленый гептановый (бензиновый) слой содержит хлорофиллы

“a” и “b” и каротин;

нижний – желтый спиртовой содержит ксантофиллы.

Б. Омыление хлорофилла щелочью.

Молекула хлорофилла представляет собой эфир двухосновной хлорофиллиновой кислоты с двумя спиртами – фитолом и метанолом. При реакции со щелочью хлорофилл омыляется, давая соответствующие соли и спирты:

COOCH₃ COONa

С₃₂H₃₀ON₄Mg + 2NaOH C₃₂H₃₀ON₄Mg +

COOC₂₀H₃₉COONa

+ CH₃OH+C₂₀H₃₉OH

Образующаяся при этом соль хлорофиллиновой кислоты сохраняет зеленую окраску и оптические свойства хлорофилла.

Ход определения.

В пробирку со спиртовой вытяжкой пигментов приливают 2 – 3 капли 20% раствора КОН или NаОН. Пробирку встряхивают и дают отстояться, затем добавляют равный объем гептана (бензина). При этом происходит разделение слоев:

верхний– желтый гептановый (бензиновый) из-за присутствия каротина;

нижний– зеленый спиртовой, т.к. в нем растворяются продукты омыления хлорофиллов – их щелочные соли. Здесь же находится и ксантофилл.

В. Получение феофитина и обратное замещение водорода на атом металла.

Атом Mgв молекуле хлорофилла легко замещается двумя атомами водорода при воздействии сильных кислот. Это приводит к образованию феофитина бурого цвета:

COOCH₃ COOCH₃

C₃₂H₃₀ON₄Mg + 2HCl C₃₂H₃₂ON₄ +MgCl₂

COOC₂₀H₃₉COOC₂₀H₃₉

Если на феофитин подействовать солями Cu,Zn,Pb, то вместо двух атомов водорода в ядро хлорофилла входит соответствующий металл, и вновь восстанавливается зеленая окраска:

COOCH₃ COOCH₃

C₃₂H₃₂ON₄ + Cu(CH₃COO)₂ C₃₂H₃₀ON₄Cu +

COOC₂₀H₃₉COOC₂₀H₃₉

+ 2CH₃COOH

Ход определения.

В две пробирки берут 2 – 3 мл спиртовой вытяжки пигментов и прибавляют 2 – 3 капли 10% HCl. При взбалтывании зеленая окраска хлорофилла переходит в бурую, характерную для феофитина. Далее одну пробирку с феофитином оставляют для контроля, а во вторую вносят несколько кристаллов уксуснокислой меди, раствор нагревают на водяной бане. После нагревания бурый цвет раствора меняется на зеленый вследствие образования хлорофиллоподобного производного меди.

Реактивы и оборудование.

1. CaCO₃сухой,

2. Этанол,

3. Гептан (бензин),

4. 20% NaOH,

5. 10% HCl,

6. Cu(CH₃COO)₂ сухой,

7. Ступки,

8. Колбы конические 50 мл,

9. Воронки,

10. Фильтры,

11. Пробирки на 10 мл,

12. Пипетки на 5 и 1 мл,

13. Ланцеты,

14. Водяная баня (кипящая).

Работа 2. Разделение смеси пигментов с помощью бумажной хроматографии.

Хроматографический метод разделения пигментов, впервые предложенный русским ученым М.С. Цветом, заключается в том, что раствор, содержащий смесь пигментов, пропускают через слой адсорбента. Различные пигменты, обладая неодинаковой растворимостью в данном растворителе и разной адсорбируемостью, передвигаются по мере движения растворителя с различной скоростью и располагаются на адсорбенте в разных местах. Чем выше растворимость пигмента в растворителе, тем быстрее он будет передвигаться, и тем дальше от старта будет располагаться зона этого пигмента.

Ход работы.

Измельченные свежие листья помещают в ступку, добавляют немного CaCO₃для нейтрализации органических кислот клеточного сока, а также кварцевого песка или толченого стекла и растирают, постепенно приливая ацетон (на 2 – 3 г листьев примерно 25 мл ацетона). Полученный раствор фильтруют в сухую чистую колбу.

Наливают вытяжку в бюкс и погружают в нее кончик полоски из хроматографической бумаги (320 см). Через несколько секунд, когда вытяжка поднимется по бумаге на 1 – 1.5 см, высушивают бумагу на воздухе и снова погружают в раствор пигментов на несколько секунд. Эту операцию повторяют 5–7 раз до тех пор, пока у верхней границы распространения пигментов на бумаге не образуется темно-зеленая полоска. После этого погружают кончик бумажной полоски в ацетон, чтобы все пигменты поднялись на 1 – 1.5 см.

Высушив полоску до полного исчезновения запаха ацетона, ее помещают в вертикальном положении в хроматографическую камеру (цилиндр, на дно которого налита смесь растворителей бензин : бензол в отношении 1:2) и плотно закрывают крышкой.

Через 10 – 15 мин растворитель поднимается по бумаге на 10 – 12 см, при этом пигменты располагаются в виде полос в следующем порядке:

каротины (поднимаются с фронтом (растворителя)

ксантофиллы

хл. а

хл. b

Рис.1. Распределение пигментов на бумаге.

Вклеивают полученную хроматограмму в отчет, подписывают пигменты и делают вывод о причинах разделения пигментов на бумаге.

Реактивы и оборудование.

1. Ацетоновая вытяжка пигментов,

2. Бензин (гептан),

3. Бензол,

4. Хроматографическая бумага,

5. Хроматографическая камера,

6. Пинцет.

Работа 3. Сравнение качественного состава пигментов высших растений разных систематических групп.

Объектами сравнения служат листья высших растений различных систематических групп. Смесь пигментов разделяют при помощи различных видов хроматографии – например, на бумаге или на пластинках силуфола.

Ход работы.

Разделение пигментов производят на пластинках силуфола (UV-254, Чехословакия) размером 315 см.Силуфол – это пластинки для тонкослойной хроматографии на алюминиевой фольге. В качестве сорбента используют силикагель, связывающим веществом является крахмал.

На пластинки силуфола с помощью микропипетки наносят спиртовую вытяжку пигментов полоской 1.5 см на расстоянии 2 см от нижнего края пластинки. Полоску подсушивают струей воздуха (вентилятор), а затем помещают в хроматографическую камеру, предварительно насыщенную смесью растворителей следующего состава:

гептан : ацетон : эфир : гексан

10 : 10 : 3 : 10

На одну пластинку наносят вытяжку пигментов высших растений разных систематических групп. Разгонку пигментов производят в камере с плотно закрытой крышкой и затемненной темной бумагой. Фронт растворителя поднимается вверх до 2 см от верхнего края пластинки. Хроматограмму вынимают и высушивают в токе воздуха.

Полученную хроматограмму вклеивают в отчет с помощью прозрачного скотча, расшифровывают (рис.2) и подписывают.

/\/\/\/\/\/\/\/\ Каротины

/\/\/\/\/\/\/\/\ Феофитин

/\/\/\/\/\/\/\/\ Артероксантин

/\/\/\/\/\/\/\/\ Хл. а

/\/\/\/\/\/\/\/\ Хл. b

/\/\/\/\/\/\/\/\ Лютеин + зеаксантин

/\/\/\/\/\/\/\/\ Виолаксантин

/\/\/\/\/\/\/\/\ Неоксантин

Старт

Рис.2. Распределение пигментов на силуфоле.

Реактивы и оборудование.

1. Спиртовая вытяжка пигментов

2. Растворитель (гептан : ацетон : эфир : гексан – 10 : 10 : 3 : 10)

3. Пластинки силуфола

4. Микропипетки

5. Вентиллятор

6. Хроматографическая камера.

Работа 4. Определение содержания основных пигментов фотосинтетического аппарата в листьях высших растений.

Объектом определения служат листья высших растений разных видов или листья разного возраста. Содержание хлорофиллов “a” и “b” определяют спектрофотометрически, рассчитывают соотношениехл. а / хл.bв исследуемом материале.

Работа проводят в два этапа:

- экстракция пигментов;

• определение их концентрации с помощью спектрофотометра или ФЭКа

(фотоэлектроколориметра).

Пигменты могут быть экстрагированы из свежего или фиксированного материала с помощью смеси полярных (спирт, ацетон) и неполярных (эфир, гексан, бензин) растворителей. Полярные растворители расщепляют связь между пигментом и белком и переводят все пигменты в раствор. Поскольку пигменты быстро выцветают на свету, экстрагировать их лучше в затемненном помещении.

Количественное определение пигментов основано на использовании их оптических свойств. В зависимости от природы растворителя для расчетов используют следующие формулы:

а) в 80%-ном ацетоне:

C_a= 12.7D₆₆₃– 2.58D₆₄₄ (мг/л)

C_b= 22.9D₆₄₄– 4.66D₆₆₃(мг/л)

б) в серном эфире:

C_a= 9.93D₆₆₀– 0.78D₆₄₂(мг/л)

C_b= 17.6D₆₄₂– 2.81D₆₆₀(мг/л), где

С_a,C_b– концентрация хлорофилла а, хлорофиллаb, соответственно,

D₆₆₃,D₆₄₄, … - оптическая плотность раствора при указанной длине волны

Возможно определение концентрации пигментов по заранее построенным калибровочным кривым.

Ход определения.

Навеску растительного материала (500 мг) растирают в присутствии CaCO₃с 4 – 5 мл 80%-ного ацетона. Полученную вытяжку фильтруют в сухую колбочку. Операцию повторяют несколько раз, пока стекающая жидкость не будет прозрачной. Вытяжку помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем растворителем. Полученная вытяжка содержит сумму зеленых и желтых пигментов.

Концентрацию хлорофилла определяют с помощью ФЭКа. Используя красный светофильтр (650 нм) и кюветы шириной 10 мм, определяют оптическую плотность раствора относительно чистого растворителя (ацетона). Для предотвращения испарения ацетона кюветы лучше закрыть крышечками. Результаты получаются надежными при показаниях ФЭКа от 0.1 до 0.4. Если оптическая плотность выше 0.5, то вытяжку следует разбавить. Если же показания ФЭКа меньше 0.08, работу следует повторить с самого начала, взяв большую навеску.

Измерения повторяют несколько раз, а из полученных отсчетов берут среднее арифметическое, затем определяют концентрацию хлорофилла в вытяжке по калибровочному графику (рис.3).

Содержание хлорофилла в листьях пересчитывают на 1 г сырого веса листьев. Для этого полученное по графику значение умножают на объем вытяжки – находят количество мг хлорофилла в суммарной вытяжке. Эта вытяжка была получена из 500мг сырого веса листьев, следовательно, для расчета на 1 г сырого веса, полученный результат следует умножить на 2.

Рис.3. Оптическая плотность ацетоновой вытяжки хлорофилла.

Реактивы и оборудование.

1. СаСО₃сухой

2. 80% ацетон

3. Колбы 50 мл

4. Мерные колбы на 25 мл

5. Ступки

6. Ножницы

7. ФЭК, спектрофотометр

8. Кюветы шириной 10 мм

9. Бумажные фильтры