5. Проведение методики оценки задержки клеточного цикла лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии

5.1. Выделение лимфоцитов периферической крови человека на градиенте фиколл-урографин

В стерильную центрифужную пробирку вносят 1 мл стерильного раствора фиколл-урографина. Кровь в шприце хорошо перемешивают и наслаивают по стенке 4 мл крови. Центрифугируют 25 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту при комнатной температуре.

Аккуратно забирают кольцо лимфоцитов с частью плазмы и помещают в чистую стерильную пробирку. Проводят 3-кратную отмывку средой Хенкса (199).

5.2. Культивирование лимфоцитов периферической крови человека

Приготовление культуральной среды: подписывают бакпечатки, вскрывают их. Вносят стерильным шприцом в каждую бакпечатку 4 мл среды RPMI, 0.5 мл эмбриональной телячьей сыворотки и 130 мкл ФГА наконечником. Аккуратно перемешивают.

Выделенную клеточную суспензию хорошо перемешивают и равномерно разделяют на две части.

Клеточную суспензию, предназначенную для оценки спонтанного уровня клеток, фиксируют не позднее 30 минут.

Клеточную суспензию, предназначенную для оценки уровня клеток после стимуляции клеток к делению, инкубируют в бакпечатках 42 часа в термостате при температуре +37°C.

5.3. Анализ пролиферативной активности лимфоцитов с использованием набора Кi-67

Клеточную суспензию из бакпечаток переливают в чистые центрифужные пробирки, подписывают. Центрифугируют 7 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту. Добавляют 200-250 мл Cytofix/Cytoperm, перемешивают и инкубируют 15 минут при температуре +4°С. Центрифугируют 7 минут со скоростью 1500 оборотов в минуту. Затем проводят 2-кратную отмывку раствором Perm/Wash. Добавляют 1000 мл охлажденного 70% спирта, хорошо перемешивая, и инкубируют на льду не менее 2 часов.

Окраска Ki-67. Клеточную суспензию по окончании фиксации однократно отмывают раствором BSA или Perm/Wash. Затем снова добавляют 1 мл раствора BSA или Perm/Wash и инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость сливают.

Добавляют 100 мкл буфера BSA, перемешивают и переносят по 100 мкл клеточной суспензии в чистые пробирки для проточного цитометра. В первую пробирку добавляют 8 мкл изотипического негативного контроля, во вторую – 8 мкл анти-Ki-67. Инкубируют 40 минут при комнатной температуре в темноте. Затем проводят 2-кратную отмывку раствором BSA или Perm/Wash.

Добавляют 450 мкл PI/RNase, инкубируют 30 минут при комнатной температуре в темноте.

5.4. Анализ проб на проточном цитометре

Принципы проточной цитометрии весьма просты. Клетки или ядра поодиночке пересекают сфокусированный световой пучок, обычно лазерный. Свет определенной длины возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценить сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и разлагают на компоненты. Световые сигналы детектируют, преобразуют в электрические импульсы и далее в форму, удобную для компьютерной обработки и хранения информации.

Анализ проб проводят с учетом правил проточной цитометрии.

Первая гистограмма (FSxSS) предназначена для выделения области лимфоцитов. Оно проводится по соотношению размера клеток (FS) и ее гранулярности (SS).

Вторая гистограмма (Main) необходима для исключения дебриса (мусора).

На третьей гистограмме выделяют область клеток, окрашенных ДНК-тропным красителем PI и красителем FITS, конъюгированным с антителами против белка Ki-67. Все клетки, попадающие в эту область, считаются как Ki-67-положительные.