3. Нарушения регуляции клеточного цикла и канцерогенез

Нарушение нормальной регуляции клеточного цикла является причиной появления большинства твердых опухолей. В клеточном цикле прохождение контрольных пунктов возможно только в случае нормального завершения предыдущих этапов и отсутствия поломок. Для опухолевых клеток характерны изменения компонентов сверочных точек клеточного цикла. При инактивации сверочных точек клеточного цикла наблюдается дисфункция некоторых опухолевых супрессоров и протоонкогенов.

В основе образования опухоли лежит избыточное размножение определенных клеток. Совершенно естественно поэтому, что нарушения регуляции клеточного цикла являются неотъемлемым и основополагающим признаком неопластической клетки. "Мотором" клеточного цикла, как известно, служат активности последовательно сменяющих друг друга циклинзависимых киназ.

Регуляция активности циклинзависимых киназ осуществляется за счет направленного изменения уровня определенных циклинов в определенные фазы клеточного цикла. Кроме того, активность Сdk регулируется изменениями фосфорилирования их определенных аминокислотных остатков. В активной форме комплексы циклин-Cdk фосфорилируют регуляторные белки, контролирующие протекание данной фазы.

Большинство известных протоонкогенов и опухолевых супрессоров тем или иным образом регулируют активность циклинзависимых киназ, ответственных за вход в S-фазу клеточного цикла. Продукты некоторых из клеточных (Mdm2) или вирусных (Т-антиген вируса SV40, E1A аденовирусов, E7 HPV и др.) онкогенов связывают и инактивируют основной субстрат таких Cdk - pRb. Нарушения в сигнальных путях Cdk2,4/6 - pRb - E2F/DP являются необходимыми для появления постоянно пролиферирующих неопластических клеток. Нарушение регуляции клеточного цикла - это способ подстегнуть клетку к нерегулируемому размножению.

Раковые клетки могут производить избыточные количества циклина D и циклина Е, в них могут отсутствовать такие ключевые регуляторы клеточного цикла, как р53 или р16. Белок p53 является одним из факторов транскрипции, который инициирует синтез белка p21, являющегося ингибитором комплекса CDK-циклин, что приводит к остановке клеточного цикла в G1 и G2 периоде. Таким образом клетка, у которой повреждена ДНК, не вступает в S-фазу. При мутациях, приводящих к потере генов белка p53, или при их изменениях, блокады клеточного цикла не происходит, клетки вступают в митоз, что приводит к появлению мутантных клеток, большая часть из которых нежизнеспособна, другая — дает начало злокачественным клеткам.

4. Клеточный цикл и ионизирующее излучение

В случае возникновения нарушений, вызванными различными экзогенными факторами (в том числе и радиацией) клетка приостанавливает продвижение по клеточному циклу. Иногда – на некоторое время, если последствия воздействий среды окажутся обратимыми. Иногда – навсегда, если последствия окажутся необратимыми.

Облучение клеток в очень высоких дозах (несколько десятков грей) может вызвать мгновенное прекращение метаболизма и разрушение клетки. Этот тип гибели, часто называемый "немитотической" или "интерфазной" гибелью, наблюдается в неделящихся или редко делящихся клетках, таких, например, как клетки печени взрослых жи­вотных, почек, мышечной и нервной ткани.

Однако облучение в гораздо более низких дозах также может привести к гибели клеток подавлением способности к делению. Этот вид клеточ­ной гибели, которую можно определить как потерю клеткой способнос­ти к неограниченному размножению, назывеют "репродуктивной ги­белью". Клетки, способные к ограниченному делению после облучения, дающие стерильное потомство, считаются погибшими, несмотря на то, что с морфологической, физиологической и биохимической точек зрения они кажутся нормальными. Таким образом, термин "репродуктивная гибель" относится как к клеткам делящимся, но постепенно деградирую­щим после облучения в умеренных дозах, так и к клеткам, полностью утратившим репродуктивную способность.

После воздействия ионизирующего излучения происходят двунитевые разрывы ДНК. Если происходит репарация ДНК, то клеточный цикл восстанавливается, если нет - происходит гибель клетки путем апоптоза или развивается мутантный клон. Клеточный цикл при воздействии радиации может быть блокирован в двух критических точках-перехода из G1 в S и/или из G2 в М фазу.

Существуют различные методы определения гибели клеток ин витро при облучении. Например, по методу Пака популяция одиночных клеток высеивается в чашку Петри. После облучения в разных дозах определяют способность каждой клетки к делению и образованию макроколоний. Если клетка образует макроколонию, она считается выжившей, если нет — погибшей. Обычно клетки, используемые для таких экспериментов, случайно распределены по клеточному циклу.

В отличие от такого случайного распределения клеток по стадиям клеточного цикла можно получить популяции, в которых все клетки делят­ся синхронно и проходят клеточный цикл с одинаковой скоростью. Цель экспериментов — выяснение зависимости чувствительности клеток от стадии клеточного цикла, в которой они находились во время облучения (например, в митозе, синтезе ДНК и т. д.). Такие опыты возможны только в условиях ин витро, так как большинство клеточных популяций ин виво делится асинхронно. Популяции клеток ин витро и ин виво имеют тенденцию к асинхронному делению, поскольку каждая клетка немного отличается от соседней по скорости, с которой она проходит клеточный цикл.

В условиях ин витро существует несколько способов накопления кле­ток в одной определенной фазе клеточного цикла и наблюдения за син­хронным прохождением фаз. Строгая синхронность сохраняется лишь у одной или двух генераций клеток (один или два цикла деления), и за­тем индивидуальные различия между клетками приводят к постепенной ее потере.

Первый эксперимент по определению зависимости радиочувствитель­ности клеток от фазы клеточного цикла проведен в 1963 г. на линии раковых клеток человека, известных как клетки Не1_а. В этих опытах клетки, находящиеся в определенной фазе клеточного цикла, облучали однократно в дозе 3 Гр. Было установлено, что гибель клеток, вызванная облучением, существенно зависит от фазы, в которой клетки облучали. Клетки в стадии митоза были наиболее чувствительными, а клетки в на­чале G1-фазы, поздних частях S-фазы и G2 были наиболее резистентными. Клетки в начале S-фазы имели промежуточную чувствительность.

Термин чекпойнт клеточного цикла (или сверочные точки) обозначает механизмы, способные останавливать клеточный цикл в определенных точках в ответ на различные повреждения. Эти системы достаточно консервативны в эволюции (основные принципы одинаковы, как у млекопитающих, так и у низших эукариот, дрожжей), что отражает их важность не только для конкретной особи, но и для популяции в целом. Чекпойнты можно представить себе как многоуровневые системы, на «верхних этажах» которых происходит контроль повреждений, в то время как «нижние этажи» ответственны за остановку клеточного цикла при их возникновении.

Существуют различные чекпойнты, которые контролируют процессы репликации ДНК, сегрегации хромосом, следят за повреждениями ДНК, концентрацией кислорода в клетке, выявляют гиперпролиферативные сигналы. Каждая из этих систем, состоит из множества белков, различных по структуре и биохимической функции. Наиболее хорошо изученной является система, активирующаяся при повреждении ДНК. По функциональному критерию компоненты этой системы можно разделить на 3 группы: сенсоры, датчики и эффекторы. Сенсорные белки находят поврежденные участки ДНК и передают информацию датчикам, которые, в свою очередь, распределяют ее по различным эффекторам. Эффекторы активируют различные системы ответа на повреждения ДНК: комплекс репарационных белков, механизмы остановки клеточного цикла в чекпойнтах, и т.д.