MolBiol_sivolob

Розділ 3. ДНК

Розповсюджений клас білкових мотивів, що взаємодіють із ДНК, – Zn-координуючі мотиви. Це дуже невеличкі структурні елементи, які складаються з обмеженої, недостатньої для формування жорсткої глобули, кількості сегментів вторинної структури. Іон цинку надає жорсткості такому мотиву, утворюючи координаційні зв'язки з чотирма амінокислотними залишками, частіше Cys або His. Координаційний зв'язок формується неподіленою парою електронів атомів O, N або S, яка узагальнюється з атомом металу шляхом часткового “перетікання” на його низьку незаповнену орбіталь. Чотири такі зв'язки створюють жорсткий каркас, який утримує білкову поверхню, що має взаємодіяти з ДНК.

Один зі структурних мотивів такого типу, що часто зустрічається, – цинковий палець (Zn finger, рис. 3.15, а). Він має дуже просту будову: одна α-спіраль і маленький β-шар із двох β-ділянок; одна з них і α-спі- раль містять залишки, що утворюють координаційні зв'язки з Zn. Як правило, кілька таких пальців (три на рис. 3.15, а), з'єднаних перемичкою, спірально обгортають великий жолобок.

Інший приклад – ДНК зв'язувальний домен гормонового рецептора (рис. 3.15, б). Гормонові рецептори – це еукаріотичні фактори транскрипції, здебільшого гомодимери, які набувають споріденості з певними елементами послідовності ДНК після зв'язування з білком стероїдного гормону (розділ 6). ДНК-зв'язувальний домен має дві пари структурних елементів, а саме α-спіраль – суміжна нерегулярна петля, кожна пара координує іон Zn. Одна пара елементів бере участь у димеризації, інша – у взаємодії з ДНК. Зустрічаються також інші Zn-координуючі мотиви, але всі вони, як і розглянуті, реалізують взаємодію α-спіралі з великим жолобком.

Ще один мотив, який взаємодіє з великим жолобком ДНК за рахунок α-спіралей – лейциновий зіпер (Leu zipper, рис. 3.16). Він являє собою дві довгі α-спіралі, кожну з яких можна розділити на дві частини. Одна частина обох спіралей здійснює димеризацію – за рахунок гідрофобних взаємодій між неполярними амінокислотними залишками (часто Leu, звідки назва мотиву) утворюється трохи закручена подвійна спіраль (coiled coil). Друга частина кожної α-спіралі взаємодіє з великим жолобком ДНК.

Варіацією лейцинового зіпера є мотив спіраль – петля – спіраль (helix – loop – helix) – різниця лише в тому, що кожна довга α-спіраль розділена на дві коротші, з'єднані петлею: одна пара спіралей взаємодіє між собою, інша – з ДНК.

83

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Рис. 3.15. Три цинкових пальця у складі ДНК-зв'язувального білка (а, 1ZAA)

і ДНК-зв'язувальний домен (димер) глюкокортикоїдного рецептора (б, 1GLU). Зелені сфери – іони Zn

Рис. 3.16. Лейциновий зіпер (1NWQ)

84

Розділ 3. ДНК

Усе це не означає, що тільки α-спіраль використовується для взаємодії білків з великим жолобком ДНК. У великий жолобок добре вкладається також β-шар із двох β-ділянок – саме такий шар є взаємодіючим елементом для білків типу метіонінового репресора. Численний клас білків становить родину імуноглобуліноподібних траскрипційних факторів (глобула має укладку імуноглобулінового типу, див. рис. 2.12, б), які реалізують взаємодії перемичок між ділянками β-структури з великим жолобком. Отже, хоча α-спіраль використовується частіше, реалізуються і всі інші можливості.

Усе описане не означає також, що білки взаємодіють з ДНК тільки через великий жолобок (хоча через великий – частіше). На рис. 3.17 зображено приклади взаємодії перемичок між α-спіралями (а) чи витягнутого поліпептидного ланцюга (б) з маленьким жолобком. У першому випадку – димер гістонів у складі нуклеосоми (див. розділ 4) – маємо ще один структурний мотив, який зустрічається і в інших ДНК-зв'язувальних білках, а саме гістонову укладку: одна довга α-спіраль фланкована двома короткими. Димер двох таких укладок взаємодіє з ~2,5 витками подвійної спіралі. У випадку гістонів ця взаємодія не є специфічною: утворюються електростатичні контакти позитивно заряджених амінокислотних залишків з фосфатами ДНК, але з боку маленького жолобка.

Рис. 3.17. Димер гістонів Н3-Н4 (а, 1AOI) і АТ-гак у складі білка HMGA (б, 2EZD)

Другий приклад (рис 3.17, б) стосується білків HMGA – білків групи високої рухливості (High Mobility Group) типу А (HMG – істо-

85

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

рична назва для білків різних структурних класів, мається на увазі рухливість при електрофорезі). Білки HMGA взагалі не мають глобулярної структури – є невпорядкованими. Вони містять 3 пентапептидні елементи (Pro-Arg-Gly-Arg-Pro), що називаються АТ-гаками (АТ-hook). Такий гак добре укладається у звужений маленький жолобок невеликої ділянки подвійної спіралі, збагаченої АТ-парами (тобто АТ-гак має специфічність до невеликих АТ-збагачених сайтів, завдяки чому він і отримав свою назву).

Наступні приклади стосуються дуже важливих випадків взаємодії елементів регулярної вторинної структури білків з маленьким жолобком. Оскільки α-спіраль і дволанцюговий β-шар добре укладаються у великий жолобок, це автоматично означає, що в маленькому жолобку їм не вистачає місця. Відповідно, така взаємодія буде можливою тільки за умови суттєвої деформації подвійної спіралі ДНК (розширення жолобка) – ефект, що має важливі функціональні наслідки. На рис. 3.18 зображено досить розповсюджений мотив – HMG-бокс, який, зокрема, входить до складу білків HMGВ (ще один клас білків HMG). Мотив складається з трьох α-спіралей, дві з них (позначені червоним) вбудовуються (інтеркалюють) у маленький жолобок. Це супроводжується розкрученням подвійної спіралі й вигином на ~80° у протилежний щодо білка бік. Серед HMG-боксів є як специфічні до певних послідовностей пар основ, так і неспецифічні.

Рис. 3.18. HMG-бокс у складі білка HMGВ (1J5N)

86

Розділ 3. ДНК

У складі білка ТВР (TATA-box Binding Protein) – важливого елемента ініціації транскрипції в еукаріотів – досить широкий β-шар взаємодіє з маленьким жолобком подвійної спіралі в зоні ТАТА-боксу – регуляторного елемента послідовності ДНК (розділ 6). Наслідком цієї взаємодії також є значна деформація подвійної спіралі з її розкрученням і значним вигином у протилежний від білка бік (рис. 3.19). Вигин, як і у випадку HMG-боксу, підсилюється інтеркаляцією двох гідрофобних амінокислотних залишків між парами основ. У місці інтеркаляції порушуються стекінг-взаємодії та утворюється кінк (kink) – різкий злам подвійної спіралі.

Рис. 3.19. ДНК-зв'язувальний домен ТВР у комплексі з ТАТА-боксом (1QNE)

На відміну від розглянутих факторів транскрипції та структурних білків, ферменти, які працюють на ДНК, досить важко описати в термінах простих структурних мотивів. Ферменти використовують складні комбінації різноманітних елементів білкової структури для впізнання ДНК і зв'язування з нею. Два приклади – мономерна ДНКаза І (неспецифічна ендонуклеаза, яка здійснює одноланцюговий розріз в ділянці маленького жолобка) і гомодимерна рестриктаза EcoRV – зображені на рис. 3.20.

87

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

Рис. 3.20. Комплекси з ДНК ДНКази І (а, 1DNK) і рестриктази EcoRV (б, 1AZ0)

Принципи білково-нуклеїнового впізнання

Усі випадки взаємодії численних білків із ДНК можна поділити на дві категорії: неспецифічне зв'язування білка з ДНК будь-якої послідовності (характерна константа зв'язування K ~ 105–106 л/моль, визначення константи зв'язування див. у розділі 1) і специфічне впізнання білком певної послідовності пар основ (із константою ~109–1010 л/моль). Білки, що здійснюють таке впізнання, як правило, взаємодіють і з будь-якою іншою ДНК неспецифічно. Розглянемо на простому прикладі, що практично означають наведені цифри.

Нехай у бактеріальній клітині радіусом 1 мкм міститься 10 молекул певного білка та 4 млн 600 тис. пар основ ДНК, де присутня одна специфічна ділянка (оператор). Виходячи з об'єму клітини, можна легко розрахувати загальні молярні концентрації білка та оператора (скориставшись числом Авогадро). Концентрація комплексу з оператором визначається рівнянням (1.6), де вільні концентрації білка та оператора дорівнюють їхнім загальним концентраціям мінус концентрація комплексу. Звідки, якщо відома K, можна розрахувати концентрацію комплексу.

Якщо білок зв'язується неспецифічно (K = 105 л/моль), відношення концентрації комплексу до загальної концентрації оператора дорівнює 4·10–4 – оператор практично є вільним від білка. Та якщо замість концентрації оператора використати загальну концентрацію потенційних сайтів зв'язування на ДНК (білок зв'язується будьде), яка є в 4 млн 600 тис. разів вищою (кожна пара основ потенційно може бути початком сайта зв'язування), то відношення кон-

88

Розділ 3. ДНК

центрації комплексу до загальної концентрації білка дорівнюватиме 0,995 – практично білок увесь час зв'язаний із ДНК.

При специфічному зв'язуванні (K = 1010 л/моль), відношення концентрації комплексу до загальної концентрації оператора дорівнює 0,97 – десяти молекул білка виявляється достатнім, щоб більшу частину часу оператор був зв'язаним. При цьому з оператором у нашому прикладі в даний момент часу може бути зв'язана лише одна молекула білка, решта перебуває не у вільному стані, а на ДНК, взаємодіючи з нею неспецифічно.

Чим визначається висока специфічність зв'язування? Головне пра-

вило білково-нуклеїнового впізнання – відсутність жорстких правил.

Розглянуті різні структурні мотиви білків є різними еволюційними рішеннями для специфічної взаємодії з тією чи іншою послідовністю: існує багато шляхів для того, щоб сформувати білкову поверхню для впізнання послідовності пар основ. Не існує і будь-якого коду впізнання – чіткої відповідності між амінокислотними залишками та парами основ. Але є певні загальні закономірності, частина яких уже має бути зрозумілою з розгляду ДНК-зв'язувальних структурних мотивів. Зокрема, білково-нуклеїновий інтерфейс частіше представлений парою α-спіраль – великий жолобок завдяки хорошій просторовій відповідності між цими двома елементами. Проте використовуються також і β-структура, і перемички між елементами вторинної структури для впізнання пар основ у великому жолобку. Маленький жолобок також використовується для впізнання послідовностей пар основ, причому у випадку взаємодії елементів вторинної структури білка (α-спіраль чи β-структура) із маленьким жолобком така взаємодія супроводжується розкриттям маленького жолобка. Таке розкриття стає можливим унаслідок значної деформації подвійної спіралі (розкручування, вигин, кінк у результаті порушення стекінг-взаємодій).

На поверхні ДНК розташовані фосфатні залишки та донорні / акцепторні групи азотистих основ у жолобках. Саме ці групи й залучаються до контактів з амінокислотними боковими залишками та пептидними групами на поверхні білка. Існує декілька типів контактів

(взаємодій) між ДНК і білками:

Електростатичні взаємодії між позитивно зарядженими амінокислотними залишками та негативно зарядженими фосфатами присутні майже завжди в білково-нуклеїнових комплексах. Зрозуміло, що електростатичні взаємодії відповідають за неспецифічне зв'язування. Як правило, вони додатково стабілізують також і специфічні комплекси. Електростатичне зв'язування білка з нуклеїновою кислотою має цілком ентропійну природу (див. також розділ 1). Висока концентра-

89

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

ція негативних зарядів (фосфатів) на поверхні ДНК зумовлює формування навкруг ДНК “іонної атмосфери” з досить високою локальною щільністю катіонів (рис. 3.21). Зв'язування позитивно зарядженого білка призводить до визволення частки катіонів у зовнішній розчин, тобто до зростання невпорядкованості (ентропії) у системі. Енергетичний виграш від зв'язування білка (його спорідненість до ДНК) є тим більшим, чим меншою є концентрація солі в розчині, тобто різниця між концентрацією катіонів поблизу від ДНК і на віддаленні від неї.

Рис. 3.21. Електростатичне зв'язування білка (червоним позначені позитивно заряджені амінокислотні залишки)

з ДНК за рахунок визволення неорганічних катіонів

Водневі зв'язки між донорно-акцепторними групами білка та фосфатами й екзоциклічними групами азотистих основ. Водневі зв'язки, оскільки вони потребують чіткої взаємної орієнтації донора й акцептора, відіграють роль головного фактора специфічного впізнання. Кожна послідовність пар основ утворює в жолобках подвійної спіралі власний патерн донорних і акцепторних груп (рис. 3.22, див. також рис. 3.7), який і може впізнаватися поверхнею білка. Слід зазначити, що цей патерн більш варіабельний у великому жолобку, де легше розрізнити пари основ і динуклеотидні контакти – це ще одна причина, чому саме великий жолобок частіше використовується для впізнання. Деякі амінокислотні залишки здатні утворювати два водневі зв'язки з азотистою основою, наприклад, Arg із гуаніном. Проте Arg контактує й з усіма іншими основами. Чи буде певний залишок залученим до утворення водневого зв'язку, і якого саме, залежить від його орієнтації на поверхні. Певні закономірності (своєрідний код, коли залишок пев-

90

Розділ 3. ДНК

ного типу в певному місці утворює зв'язок із певною основою) спостерігаються іноді тільки в межах однієї родини структурних мотивів, але й тоді такі закономірності не мають абсолютного характеру.

Рис. 3.22. Патерни донорів і акцепторів водневого зв'язку в жолобках подвійної спіралі для зазначеної послідовності чотирьох пар основ

Водневі зв'язки, опосередковані молекулами води. Вода взаємодіє з поверхнями як білків, так і ДНК. Визволення води з білково-нуклеї- нового інтерфейсу вносить додаткову ентропійну складову у стабілізацію комплексу. Але досить часто окремі молекули води можуть залишатися в інтерфейсі, виконуючи роль біфункціональної зшивки – утворюючи водневі зв'язки з білковими групами та фосфатами або групами азотистих основ.

Гідрофобні контакти можуть здійснюватись за участю метильної групи тиміну у великому жолобку (рис. 3.7), але суттєвішими

єгідрофобні взаємодії при інтеркаляції неполярних амінокислотних залишків між парами основ при деформації подвійної спіралі внаслідок занурення елементів вторинної структури білка в маленький жолобок (рис. 3.18, 3.19).

Головною умовою реалізації названих контактів між ДНК і білком

єзаємна підгонка структури взаємодіючих елементів унаслідок від-

повідних конформаційних перетворень. Так, шляхом певних конфор-

маційних змін подвійної спіралі (вигини спіралі, зміни твіста тощо) змінюється розмір жолобків, хімічні групи “підводяться” під водневі зв'язки та міцні електростатичні контакти, збільшується загальна поверхня, що може взаємодіяти з білком. Це означає, що для ефективного впізнання необхідна певна конформація подвійної спіралі

91

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

та / або певні зміни цієї конформації. І те, й інше визначається послідовністю пар основ. Отже, основою для білково-нуклеїнового впізнання є структурно-динамічний поліморфізм нуклеотидних послідовностей – залежні від послідовності структурні особливості та конформаційна рухливість подвійної спіралі.

а

б

Рис. 3.23. Структура ДНК-зв'язувальних доменів димеру репресора лактозного оперона E. coli

у комплексі з неспецифічною ДНК (а, 1OSL) та зі своїм специфічним оператором (б, 1L1M)

При цьому білок також часто потребує певної конформаційної підгонки під подвійну спіраль. Один із прикладів такої, досить значної, конформаційної зміни як у молекулі білка (формування додаткових α-спіралей), так і у молекулі ДНК (вигин подвійної спіралі) при утворенні специфічного комплексу показано на рис. 3.23. Саме в процесі взаємної конформаційної підгонки білка та ДНК і реалізується специфічний патерн контактів у інтерфейсі між двома молекулами. Від того, наскільки легко потрібні конформаційні зміни відбуваються при зустрічі конкретного білка з конкретною послідовністю пар основ, залежить ефективність упізнання. Таким чином, головним механізмом упізнання послідовності ДНК білком є структурно-динамічна комплементарність двох молекул.

92