MolBiol_sivolob

Розділ 8. Синтез білків

E P A

мРНК

Рис. 8.11. Взаємне розташування трьох молекул тРНК у рибосомі (дві проекції приблизно збігаються з проекціями на рис. 8.9 і 8.10)

Аа-тРНК потрапляє до рибосоми через щілину між субодиницями (рис. 8.9), розмір якої може змінюватись унаслідок рухливості структурних елементів рибосоми. Так само й розмір “воріт”, через які тРНК виходить із Е-сайта, модулюється рухливістю виросту L1.

Функціональну схему рибосоми наведено на рис. 8.12: систему зображено в момент перед додаванням четвертої амінокислоти до ланцюга, що синтезується; показано аа-тРНК, пептидил-тРНК і деаміноацильовану тРНК, що зв'язані відповідно з А-, Р- і Е-сайтами. Центральні сайти, навколо яких відбувається вся робота рибосоми – сайти зв'язування тРНК – формуються обома субодиницями. Між субодиницями існує своєрідне відносне розділення праці: маленька субодиниця, яка взаємодіє з мРНК та антикодоновими частинами тРНК, відповідає головним чином за декодуючу функцію рибосоми, а велика, яка взаємодіє з акцепторними частинами тРНК – за каталітичну функцію.

Рибосомні РНК становлять ~2/3 маси рибосоми й саме вони визначають її структуру та функції. Полінуклеотидний ланцюг рРНК утворює велику кількість подвійних спіралей, з'єднаних петлями, – переважно це шпильки, проте відбувається і спарювання між віддаленими по ланцюгу ділянками. Загалом ланцюг утворює складну просторову структуру, де подвійні спіралі взаємодіють одна з одною та з одноланцюговими ділянками. Зокрема, аденозини одноланцюгових ділянок досить часто взаємодіють з маленьким жолобком подвійних спіралей, стабілізуючи структуру.

У складі 16S рРНК близько половини нуклеотидів залучено до ~60 коротких дволанцюгових ділянок середньою довжиною вісім пар основ. Але зазвичай у складі 16S РНК виділяють 45 більш-менш

235

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

суцільних (із короткими неспареними ділянками всередині) подвійних спіралей. За своєю загальною Y-подібною формою 16S рРНК майже не відрізняється від маленької субодиниці рибосоми (рис. 8.13, порівн. рис. 8.8) – просторова структура чітко розділяється на чотири структурні домени: 5'-кінцевий формує тіло маленької субодиниці, центральний – платформу, так званий 3'-кінцевий мажорний домен – головку, 3'-кінцевий мінорний, який складається з довгої спіралі 44 (порядковий номер) і коротшої останньої спіралі 45, формує інтерфейс взаємодії з великою субодиницею. На цей РНК-скелет у складі маленької субодиниці “нарощуються” білки, однак загальна форма зберігається. При цьому сайти зв'язування мРНК і антикодонових частин тРНК формуються переважно 3'-кінцевою зоною 16S рРНК майже без участі білків; взаємодія між субодиницями також переважно забезпечується контактами РНК-РНК.

Рис. 8.12. Функціональна схема рибосоми: червоною стрілкою позначено напрямок руху при трансляції, амінокислоти пронумеровано відповідно до порядку включення їх до ланцюга

Еукаріотична 18S рРНК є гомологічною 16S, відрізняючись кількома вставками.

У складі 23S рРНК розрізняють шість структурних доменів, але вони тісно взаємодіють один з одним. Порівняно із 16S рРНК, ця структура є значно монолітнішою (рис. 8.13). Така монолітність зумовлена головною каталітичною функцією великої субодиниці – каталіз не передбачає конформаційної рухливості, а навпаки, вимагає жорсткості просторової організації. Каталітична активність великої субодиниці

236

Розділ 8. Синтез білків

пов'язана саме з певною зоною у складі 23S рРНК, яка також взаємодіє з акцепторними частинами тРНК. Порівняно невелика 5S рРНК у комплексі з певними рибосомними білками взаємодіє з 23S, формуючи центральний протуберанець.

5'-кінцевий

Рис. 8.13. Рибосомні РНК у складі маленької (2B9O) і великої (2B9P) субодиниць рибосоми Thermus thermophilus з боку інтерфейсу взаємодії (як на рис. 8.8). Указано структурні домени рРНК 16S, довга спіраль у складі 3'-кінцевого мінорного домену – спіраль 44

Еукаріотична 5,8S рРНК є гомологічною 5'-кінцевій зоні 23S. Узагалі еукаріотичні 28S і 5,8S рРНК, які утворюють міцний комплекс між собою, – це ніби трохи подовжена за рахунок вставок 23S РНК, розділена на дві нерівні частини.

Рибосомні білки розміщуються на поверхні рРНК (відповідно, і на поверхні рибосоми). У складі маленької субодиниці платформа, щілина між платформою та головкою, а також інтерфейс взаємодії з великою субодиницею майже не містять білків, котрі розміщені головним чином на зовнішньому боці субодиниці (рис. 8.8). По поверхні великої субодиниці білки розподілені рівномірніше, хоча збідненим на них є інтерфейс взаємодії з маленькою субодиницею, і навпаки, палець L7/12 утворений кількома копіями відповідних білків без участі РНК.

Більшість рибосомних білків мають дві частини у своїй структурі: глобулу, розміщену на поверхні рибосоми, і позитивно заряджений хвіст (нерегулярна ділянка, петля або одна–дві окремі α-спіралі), який занурюється в сітку рРНК і стабілізує структуру останньої (рис. 8.14). У деяких білків глобула відсутня. Отже, усі рибосомні білки (за винятком L7/12) взаємодіють з рРНК, хоча не всі мають високу спорідне-

237

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

ність до вільної рРНК. Збирання субодиниць рибосоми з рРНК та білків (може бути здійснено in vitro без участі будь-яких факторів) відбувається поступово, через чотири–пять стадій: зв'язування частини білків на кожній стадії індукує конформаційну зміну рРНК у складі комплексу, що викликає спорідненість до нової порції білків.

L4

S9

L15

S13

Рис. 8.14. Приклади рибосомних білків у структурі рибосоми (2B9O, 2B9P).

Унизу: взаємодія білка L15 з рРНК 23S

Головна роль рибосомних білків – підтримувати функціонально активну структуру рРНК. Хоча рРНК відповідає за майже всі активності рибосоми, активної конформації вона набуває лише в комплексі з рибосомними білками. Крім того, деякі білки беруть участь у взаємодіях з елементами системи трансляції. Наприклад, білок S1, що міститься поблизу від сайта зв'язування мРНК, сприяє розплітанню дволанцюгових шпильок у складі матриці; комплекс S1–S18–S21 взаємодіє з мРНК, а також ініціаторною тРНК при ініціації трансляції; білок L10 сумісно з певною ділянкою 23S рРНК і білком L11 організує сайт зв'язування G-білків у основі стебла L7/12.

238

Розділ 8. Синтез білків

Елонгаційний цикл

Робота рибосоми під час елонгації трансляції полягає в послідовному (потриплетно) зчитуванні інформації з мРНК і відповідному приєднанні амінокислот до поліпептидного ланцюга. Кожен такий крок складається з трьох операцій, що циклічно повторюються (елонгаційний цикл). Цикл розпочинається з такої конфігурації системи, коли в Р-сайті знаходиться пептидил-тРНК, А-сайт є вільним від тРНК і в його межах на маленькій субодиниці розташований черговий кодон, який має бути впізнаним (рис. 8.15). Перша операція циклу – зв'язування аа-тРНК з А-сайтом. Зв'язування має відбутися з високою специфічністю щодо взаємодій між кодоном і антикодоном – тільки споріднена до даного кодона тРНК має бути відібрана системою. Процес розміщення аа-тРНК в А-сайті часто супроводжується дисоціацією з Е-сайта деаміноацильованої тРНК, яка залишилася там з попереднього циклу. Наслідком зв'язування є належне розташування акцепторних частин аа-тРНК і пептидил-тРНК відносно одна одної та каталітичного активного центру. У результаті рибосома здійснює другу операцію – транспептидацію – перенесення пептидилу з пептидил-тРНК на амінокислоту у складі аа-тРНК. Наслідком є перебудова системи: в А-сайті опиняється пептидил-тРНК із подовженим на одну амінокислоту пептидилом, у Р-сайті – деаміноацильована тРНК. Третя операція – транслокація – полягає в переміщенні рибосоми на один кодон уздовж мРНК (молекули тРНК залишаються зв'язаними зі своїми кодонами), після чого розпочинається наступний елонгаційний цикл.

Відбір серед різних молекул аа-тРНК на першому етапі, коли неспоріднені молекули мають швидко звільнятися, а також рух рибосоми при транслокації, передбачають реалізацію певної “відкритої”, не жорстко зафіксованої, рухливої структурної форми рибосоми. Каталіз транспептидації, навпаки, вимагає жорсткої фіксації субстратів у “закритій”, жорсткій і нерухливій формі рибосоми. Ефективне вирішення цих суперечливих завдань залежить від полегшення реалізації відкритих форм рибосоми на першому та третьому етапах елонгаційного циклу завдяки двом факторам елонгації (EF – Elongation Factors): EF1 (еукаріотичний аналог позначається як eEF1 або eEF1А, eEF – eukariotic Elongation Factor) і EF2 (еукаріотичний аналог – eEF2).

Обидва фактори належать до родини G-білків, або GTP-зв'язу-

239

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

вальних білків. Інші білки цієї родини залучені до багатьох різноманітних процесів, зокрема, є елементами асоційованих із мембранами клітинних сигнальних систем.

Рис. 8.15. Схема елонгаційного циклу

Елонгаційний фактор EF1

Фактор EF1 (часто також позначається як EF-Tu) – мономерний білок, що має три структурні домени, – може існувати у двох структурних станах (рис. 8.16). Співвідношення між вільними енергіями цих станів, а відповідно й імовірність переважної реалізації одного з них, залежить від типу ліганду (GTP чи GDP), що зв'язаний з білком (у повній відповідності до схеми на рис. 2.21). У комплексі з GDP (гуанозиндифосфат) реалізується відкрита конформація EF1 з порушеними взаємодіями між структурними доменами. Заміна GDP на GTP (гуанозинтрифосфат) приводить до локальної конформаційної перебудови в межах GTP-зв'язувального домену, унаслідок якої певні амінокислотні групи виводяться до інтерфейсу взаємодії з іншими доменами – така взаємодія відбувається і структура “замикається”. Гідроліз GTP (який здійснюється за певних умов самим білком, див. нижче) проводить до заміни ліганду і, відповідно, до зворотного перемикання конформації.

Структурна перебудова EF1 є важливою не сама по собі. GDP- і GTP-асоційовані структурні форми мають відповідно низьку та високу спорідненість до аа-тРНК і рибосом: саме у вигляді потрійного

240

Розділ 8. Синтез білків

комплексу EF1·GTP–аа-тРНК (рис. 8.17) і відбувається зв'язування аа-тРНК з рибосомою на першому етапі елонгаційного циклу. При цьому вже потрійний комплекс відіграє роль ліганду, що перемикає структурні стани рибосоми.

GDP GTP

Рис. 8.16. Структура фактора EF1 у комплексі з GDP (1TUI) і GTP (1TFT). Зелена кулька – іон Mg2+

Рис. 8.17. Комплекс EF1·GTP з аа-тРНК (1В23)

Зв'язування EF1·GTP із акцепторною частиною аа-тРНК (рис. 8.17) відбувається відразу після аміноацилювання тРНК. При завершенні процесу взаємодії з рибосомою (див. нижче) EF1 здійснює гідроліз

241

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

GTP, що веде до втрати спорідненості та дисоціації EF1·GDP. Після дисоціації молекула GDP витісняється білковим кофактором EF-Ts (еукаріотичний аналог – eEF1В), який, у свою чергу, замінюється на молекулу GTP, і знову відбувається зв'язування EF1·GТP з новою молекулою аа-тРНК.

Зв'язування аа-тРНК з А-сайтом рибосоми

Роль фактора EF1 і гідролізу GTP. Щоб аа-тРНК могла потрапи-

ти до рибосоми, рибосома має опинитися в певному “відкритому” структурному стані з розширеним каналом між субодиницями з боку стебла L7/12 (див. рис. 8.9). Крім того, така відкрита форма рибосоми не допускає дуже міцної взаємодії з аа-тРНК, тобто сприяє її легкій дисоціації в разі невідповідності між кодоном і антикодоном. Однак зрозуміло, що відкрита форма рибосоми із частково порушеними контактами (енергетично вигідними взаємодіями) між субодиницями має характеризуватися підвищеною вільною енергією, тобто є малоймовірною. Інший важливий аспект полягає в тому, що на етапі первинного перебору аа-тРНК з різними антикодонами необхідно повністю виключити для акцепторної частини тРНК можливість випадково потрапити до пептидилтрансферазного центру. Узагалі, для такого великого ліганду, як тРНК, існує кінетичний бар'єр асоціації / дисоціації: велика кількість контактів з лігандом вимагає утворювати / руйнувати їх одночасно – проміжні стани з лімітованим набором контактів мають забезпечити прискорення обох процесів. Роль EF1 саме й полягає у вирішенні зазначених проблем:

•Взаємодія EF1 з акцепторною частиною аа-тРНК залишає тільки антикодонову частину вільною для взаємодій з рибосомою (і зв'язаною з нею мРНК).

•При зв'язуванні потрійного комплексу, EF1 (який при цьому зв'язаний з акцепторною частиною аа-тРНК) взаємодіє із сайтом у основі стебла L7/12, що виключає контакт акцепторного стебла тРНК з пептидилтрансферазним центром.

•EF1·GTP має підвищену спорідненість до відкритої форми рибосоми, тобто подібно до того, як GTP перемикає конформацію самого EF1, потрійний комплекс EF1·GTP–аа-тРНК фіксує відкриту форму рибосоми, яка стає енергетично вигідною за рахунок енергії взаємодій з EF1 (рис. 8.18).

242

Розділ 8. Синтез білків

Отже, за умови присутності EF1·GTP здійснюється швидка й не дуже міцна взаємодія аа-тРНК з рибосомою (головним чином завдяки взаємодії EF1 з основою стебла L7/12), яка також швидко змінюється дисоціацією: випробування, під час яких антикодонова частина тРНК намагається впізнати кодон. Якщо таке впізнання відбувається (див. нижче), спрацьовує GTPазна активність EF1 – після гідролізу GTP фактор дисоціює, що дозволяє акцепторній частині аа-тРНК остаточно розміститися в А-сайті.

Зв'язування аа-тРНК є внутрішньою властивістю рибосоми: in vitro зв'язування може відбуватися без участі будь-яких факторів, оскільки супроводжується зниженням вільної енергії. Проте позафакторне зв'язування є досить повільним через наявність на його шляху енергетичного бар'єра – високоенергетичного відкритого стану рибосоми (рис. 8.18). Таким чином, EF1 не зумовлює зв'язування аа-тРНК, а тільки суттєво прискорює цей процес. Можна сказати, що EF1 здійснює каталіз конформаційних перетворень рибосоми за рахунок спорідненості до проміжного інтермедіатного стану. Щодо гідролізу GTP, то він потрібен лише для заміни ліганду з метою позбавитися цієї спорідненості й забезпечити дисоціацію EF1 і повернення рибосоми до закритого стану, необхідного для наступної стадії елонгаційного циклу. Але це має відбутися лише за умови впізнання кодона антикодоном аа-тРНК.

Упізнання кодона. Коли під час первинного зв'язування після кількох випробувань у межах А-сайта на маленькій субодиниці опиняється нарешті комплементарний антикодон, між ним і кодоном має утворитися коротка подвійна спіраль. Оскільки вона коротка (три пари основ), то досить нестабільна: кодон-антикодонова взаємодія за межами рибосоми є неефективною. При цьому рибосома (передусім маленька субодиниця) не тільки створює особливе середовище, яке стабілізує кодон-антикодонову спіраль, але й сприяє підвищенню специфічності – ефективно дискримінує споріднені та неспоріднені до даного кодону антикодони.

При утворенні комплементарної подвійної спіралі, з її маленьким жолобком взаємодіють два консервативні аденозини рРНК 16S (з порядковими номерами 1492 і 1493 – розташовані у верхній частині спіралі 44, див рис. 8.13), утворюючи водневі зв'язки з 2'-ОН-групами рибоз нуклеотидів кодона й антикодона (рис. 8.19). Така взаємодія, що реалізується лише за умови комплементарності, стабілізує перші дві (відносно позицій кодона) нуклеотидні пари. Друга нуклеотидна пара додатково стабілізується, також через маленький жолобок,

243

Сиволоб А.В. Молекулярна біологія

взаємодією з консервативним G530 рРНК 16S. Третя пара кодонантикодонової спіралі теж взаємодіє з певним цитидином рРНК 16S, але ця взаємодія менш специфічна й допускає неоднозначність спарювання (див. підрозділ, де йдеться про тРНК).

P A

Рис. 8.18. Зв'язування з А-сайтом рибосоми аа-тРНК

у вільному стані та в комплексі з EF1·GTP. Різні стани системи розміщені на різних рівнях відповідно до їхньої вільної енергії.

Зелена стрілка вказує оптимальний шлях процесу. Показано тільки два сайти тРНК

Взаємодії нуклеотидів рРНК 16S із кодон-антикодоновою спіраллю не тільки підвищують специфічність упізнання кодона, але й мають інший важливий наслідок. Як показано на рис. 8.19, для реалізації цих взаємодій А1492 і А1493 мають бути переорієнтованими відносно сусідніх нуклеотидів. Така локальна конформаційна перебудова запускає каскад конформаційних змін в інших частинах рРНК 16S за “принципом доміно”, що спричиняє глобальну конформаційну перебудову всієї маленької субодиниці. Зокрема, головка субодиниці переміщується в бік великої субодиниці (див. рис. 8.9), міцно замикаючи

244