закономерность важно учитывать при подозрении на острую инфекцию у женщин с малыми сроками беременности (І–ІІ триместры).

Вирус герпеса 1,2 типов (HSV-1,2) вызывает лабиальный и генитальный герпес.

Вирус герпеса 3 типа (HSV-3) протекает как ветряная оспа у детей, а ее рецидивы – как опоясывающий лишай (у взрослых).

Вирус герпеса 4 типа (HSV-4, Эпштейна-Барр, EBV) был открыт в 60-х

годах XX века. EBV поражает в основном два типа клеток: эпителий верхних дыхательных путей и пищеварительного тракта, а также В-лимфоциты, которые в результате инфицирования изменяют свои свойства. Вирус герпеса 4 типа вызывает такие заболевания, как инфекционный мононуклеоз, злокачественная лимфома Беркитта, злокачественная носоглоточная карцинома. Наиболее специфичными и чувствительными маркерами острой стадии инфекции являются IgM к капсидному комплексу (VСA) и IgG к раннему антигену (ЕА). В стадии ремиссии, переболевшие EBV, имеют IgG к ядерному антигену (EBNA).

Вирус герпеса 5 типа (HSV-5, цитомегаловирусная инфекция, CMV).

Этот вирус находится в латентном состоянии в лимфоидных органах, и при снижении иммунной способности возникают различные клинические синдромы, определяющие проявление вторичной ЦМВ-инфекции.

Вирус герпеса 6 типа (HSV-6) был выделен из лейкоцитов периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией и лимфопролиферативными заболеваниями. Он способен поражать Т-лимфоциты. Вирус герпеса 6 типа у взрослых может никак себя не проявлять, но при этом может вызывать болезненное состояние – синдром хронической усталости.

Вирус герпеса 7 типа (HSV-7) Практически все дети в возрасте до пяти лет заражены этим типом. До настоящего времени клинические признаки четко не описаны, но существуют доказательства связи заболевания с развитием энцефалита.

Вирус герпеса 8 типа (HSV-8). На начальной стадии заболевание протекает в виде мононуклеозоподобного синдрома. Позже у пациентов со сниженным иммунитетом (особенно у ВИЧ-инфицированных) развивается саркома Капоши.

Вирус иммунодефицита человека (HIV) В настоящее время основным диагностическим методом при ВИЧ-инфекции является выявление антител к вирусу, производящееся преимущественно с применением методики ИФА. В случае положительного результата исследуют сыворотку крови с помощью методики иммунного блоттинга. Это позволяет идентифицировать антитела к специфическим антигенам ВИЧ, что является достаточным критерием для окончательного диагностирования. Не выявленные с помощью иммуноблоттинга антитела не исключает ВИЧ. В инкубационный период иммунный ответ на внедрение вируса еще не сформирован, а в терминальной стадии в результате выраженного иммунодефицита антитела перестают вырабатываться.

32

При подозрении на ВИЧ и отсутствии положительных результатов иммунного блоттинга эффективным методом выявления частиц РНК вируса является ПЦР.

Вирус краснухи (Rubella). Наиболее часто краснуха встречается в детском и подростковом возрасте. Однако 20–60% женщин детородного возраста не имеют иммунитета к вирусу краснухи, так как не болели краснухой в детском возрасте и являются группой риска по заболеванию во время беременности и инфицированию плода (диагностируется как Torch-инфекция). Заболевание краснухой в течение беременности, особенно в течение первого триместра, может быть причиной серьезных осложнений у плода.

Глухота, болезни сердца, микро- и гидроцефалия являются одними из некоторых отличительных признаков синдрома врожденной краснухи.

Новорожденного ребенка с малым весом и имеющего любой из ряда перечисленных симптомов, необходимо обследовать на врожденную краснуху путем определения специфических антител класса IgМ. Специфические антитела против вируса краснухи класса IgМ определяются спустя 1–3 дня с момента появления первых симптомов заболевания. В большинстве случаев с 6-й по 9-ю неделю их титр снижается. Нередко в первые дни болезни IgМ отсутствуют, что связано с коротким инкубационным периодом. Для подтверждения положительного результата рекомендуется параллельно проанализировать образцы, взятые у тех же больных через 7–14 дней.

Инфекции органов пищеварения, ассоциированные с хеликобактером пилори (Helicobacter pylori). H. pylori – спиралевидная,

грамотрицательная бактерия, которая инфицирует различные области желудка и двенадцатиперстной кишки. Иммунодиагностика этой инфекции заключается в выявлении иммуноглобулинов класса G и A к H. pylori в сыворотке крови.

Диагностическая точность варьируется в зависимости от продолжительности воздействия бактерии, перекрестной антигенности с другими антигенно-родственными бактериями, степени гастрита и обсемененности. Кроме того, антитела сохраняются долгое время после успешного лечения, и использовать этот метод для проверки успешности лечения затруднительно. Однако, поскольку инфекция H. рylori является хронической и ее спонтанный клиренс (полное и окончательное самоизлечение лишь силами организма) невозможен, то положительные тесты на антитела у нелеченных пациентов указывают на наличие текущей инфекции. Между тем, после успешного лечения, титр антител, со временем, снижается. Достоинством этого метода является то, что анализ крови на антитела можно делать во время приема антибиотиков.

Сифилис – хроническое системное венерическое инфекционное заболевание с поражением кожи, слизистых оболочек, внутренних органов, костей, нервной системы с последовательной сменой стадий болезни, вызываемое бактериями вида Treponema pallidum (бледная трепонема).

33

Основным методом диагностики и подтверждения диагноза «сифилис» является серодиагностика. В результате взаимодействия антигенов бледной трепонемы с иммунной системой больного начинают вырабатываться три группы антител. В начале заболевания в крови обнаруживаются преимущественно IgA (флюоресцины); после появления твердого шанкра к ним присоединяются IgM (реагины), и только после этого – IgG (иммобилизины). В настоящее время для определения антител к возбудителю используется ИФА.

Наиболее распространенным является сочетание кардиолипинового теста с трепонемным ИФА. Если оба эти анализа положительны, то лабораторные данные будут трактоваться как подтверждение диагноза сифилиса. Если оба анализа отрицательные, то при отсутствии других проявлений заболевания, считается, что человек сифилисом не болен. Если кардиолипиновый тест отрицательный, а ИФА положительный, то можно предположить, что человек когда-то переболел сифилисом. При положительном кардиолипиновом тесте и отрицательном ИФА нужно повторить анализ. Такое сочетание может быть вызвано особенностями состояния иммунной системы человека (наличием ВИЧ-инфекции, вирусов гепатита, перестройкой организма в связи с беременностью и пр.).

Иммуноферментные методы способны дополнить, а порой и заменить, существующие рутинные серологические методы диагностики сифилиса (РМП, РСК). Установлено, что ранние стадии инфицирования характеризуются появлением в крови трепонемоспецифических IgМ (примерно через две недели после заражения), концентрация которых нарастает, и через два месяца достигает своих пиковых значений с последующим снижением уровня до неопределяемых величин. IgG появляются в крови только через месяц после инфицирования, однако, уже на 6-й неделе после инфицирования их уровень преобладает над уровнем IgM и может сохраняться в таком состоянии годы.

Большое диагностическое значение приобретает выявление антитрепонемных IgM в крови новорожденных. Так как IgM не проходит через плаценту, выявление антитрепонемных IgM у новорожденного указывает на врожденный сифилис. Точно так же IgM не проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), и их появление в спинномозговой жидкости (СМЖ) говорит о нейросифилисе.

Лямблиоз – кишечное заболевание, вызываемое протозойным паразитом Giardia lamblia. Острые симптомы лямблиоза могут включать в себя диарею, нарушение всасывания, спазмы кишечника, анорексию, тошноту, потерю веса, общую слабость, зачастую на фоне нормальной температуры тела, продолжающуюся от нескольких недель до нескольких месяцев.

Хроническая инфекция может протекать и без острой фазы и часто является следствием безуспешного лечения, приводящего к рецидивам заболевания.

Для диагностики лямблиоза используют определение в кале специфического антигена GSA 65, продуцируемого в больших количествах во

34

время размножения лямблии в кишечнике хозяина. GSA 65 является специфическим антигеном Giardia и не обладает перекрестной реактивностью по отношению к другим кишечным паразитам.

В сыворотке крови инвазированных лямблиями людей выявляются антитела к антигенам лямблий, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов. Попадание антигенов лямблий в периферическую кровь увеличивается при резорбции слизистой оболочки кишечника. В связи с этим выявление IgМ к специфическим антигенам лямблий в сыворотке крови может свидетельствовать о наличии острого лямблиоза, диагностика которого возможна на 10–14-й день от начала инвазии. Антитела классов IgG появляются через 2–4 недели после заражения, могут сохраняться в течение длительного периода.

Токсоплазмоз – паразитарное заболевание человека и животных, вызываемое токсоплазмами Toxoplasma gondii, в подавляющем большинстве случаев протекающее бессимптомно. Источник инвазии – различные виды домашних и диких млекопитающих. Это заболевание характеризуется полиморфизмом клинических проявлений, поражается в основном нервная система, мышцы, миокард, глаза, увеличивается печень и селезенка.

Основной метод диагностики токсоплазмоза – серологический.

Выполняется определение уровня иммуноглобулинов G с помощью ИФА. Уровень антител достигает максимального уровня через 1–2 месяца после начала заболевания и впоследствии регистрируется неопределенно долго.

У пациентов с сероконверсией или четырехкратным увеличением титра IgG определяют уровень специфических IgM для подтверждения наличия острой инфекции.

Пик концентрации антител достигается через месяц, исчезают они обычно через 6–9 месяцев, но в отдельных случаях могут периодически обнаруживаться в течение 2 и более лет, затрудняя дифференцировку острой и хронической форм инфекции

Токсокароз – заболевание человека, вызываемое миграцией личинок гельминтов, поражающих главным образом представителей псовых (Toxocara canis) и семейства кошачих (Toxocara mystax). Человек для токсокары не является окончательным хозяином, поэтому личинки паразита в его организме не достигают половой зрелости, однако они способны к длительной миграции, поражая различные органы и ткани. Прижизненный паразитологический диагноз токсокароза практически невозможен, поскольку обнаружить мигрирующие личинки трудно, а идентифицировать их по гистологическим срезам весьма непросто. Ограниченная возможность паразитологической диагностики приводит к тому, что ведущим в диагностике токсокароза является определение IgG в титре 1:800.

35

Определение IgE

Важное значение в клинической практике имеет определение IgE. Концентрация IgE в сыворотке крови возрастает постепенно с момента рождения человека до подросткового возраста. У взрослых людей концентрация IgE в норме может достигать 100 МЕ/мл. В пожилом возрасте уровень IgE иногда снижается.

IgE отличается от других иммуноглобулинов высокой цитофильностью,

т.е. способностью присоединяться к клеткам, в частности к тучным клеткам и базофилам. Присоединение антигена к IgE, находящемуся на этих клетках, приводит к выделению гистамина и других активных субстанций, что вызывает развитие реакций гиперчувствительности немедленного типа. У больных с аллергиями (астмой, сенной лихорадкой, эктопической экземой) уровень IgE в крови значительно повышен. Концентрация IgE зависит от длительности заболевания, поэтому короткие атопические приступы не вызывают ее повышения. Количество IgE увеличено в 15–20 раз при многих паразитарных заболеваниях.

36

Задания для самоконтроля

1.В КДЛ был доставлен биоматериал в пробирке – вакутейнер с красной крышкой. Назовите исследование, которое можно сделать из этой пробирки:

A.Общеклинический анализ крови

B.Протромбиновое время

C.Международное нормализованное отношение

D.Фибриноген

E.Холестерин

2.В 1400 в КДЛ была доставлена кровь больного для биохимического анализа. Кровь была набрана в отделении в 830 утра. Какой аналит будет изменяться в первую очередь?

A.Аланинаминотрансфераза

B.Холестерин

C.Глюкоза

D.Общие липиды

E.Мочевина

3.В КДЛ был доставлен биоматериал в пробирке – вакутейнер с сиреневой крышкой на 2 мл. Назовите исследование, которое можно сделать из этой пробирки:

A.Общеклинический анализ крови

B.Глюкоза

C.Тиреотропный гормон

D.Билирубин

E.Холестерин

4.В 1400 в КДЛ из кардиологического отделения была доставлена кровь пациента для проведения общеклинического анализа крови. Укажите действия персонала лаборатории.

A.Отказать в исследовании

B.Определить показатели с коэффициентом погрешности

C.Отметить на бланке ответа время поступления материала

D.Заморозить пробу для выполнения на следующий день

E.Зарегистрировать в журнале преаналитических ошибок

5.Для проведения лабораторных исследований в ходе пробоподготовки получена плазма. Для каких тестов используется данная аналитическая проба?

A.Биохимических

B.Общеклинических

C.Коагулологических

D.Гематологических

E.Иммунологических

6.При исследовании в лаборатории биоматериалов пациентов, находящихся в лечебном учреждении, часто наблюдаются неустранимые колебания ряда показателей за пределы референтных значений, что становится причиной

37

неправильной интерпретации исследований. Как называется такая вариация показателей?

A.Биологическая

B.Межиндивидуальная

C.Ятрогенная

D.Межвидовая

E.Патологическая

7.В лабораторию доставлена проба крови, набранная в вакутейнер с активатором свертывания. Визуально видно изменение цвета надосадочной жидкости. После центрифугирования полученная сыворотка – ярко-розового цвета. Охарактеризуйте полученную сыворотку:

A.Гемолизная

B.Иктеричная

C.Хилезная

D.Пригодная к использованию

E.Бактериально загрязнённая

8.В КДЛ была доставлена кровь больного в вакутейнере для исследования. Данная пробирка должна центрифугироваться только в центрифугах с горизонтальными откидывающимися стаканами. С каким наполнением данный тип вакутейнера?

A.ЭДТА К2

B.Цитратом натрия

C.Активатором свертывания

D.Разделительным гелем

E.Гепарином

9.Для биохимических исследований в лабораторию доставлена сыворотка крови. Назовите белок, который отсутствует в сыворотке и поэтому не может быть определен при данном биохимическом исследовании.

A.Глобулин

B.Альбумин

C.Тропонин

D.Иммуноглобулин

E.Фибриноген

10.В манипуляционном кабинете медсестра утром набрала кровь у больного и оставила на 2 часа у освещенного окна. Какой аналит будет изменяться в первую очередь, если кровь храниться таким способом?

A.Билирубин

B.Холестерин

C.Глюкоза

D.Креатинин

E. Мочевина

38

11. Гинеколог пациентке назначил исследование на урогенитальные инфекции методом ПЦР. К каким методам диагностики относится данное исследование?

A.Прямым

B.Серологическим

C.Бактериологическим

D.Микроскопическим

E.Непрямым

12.Врач-лаборант проводит постановку ПЦР. Положительный результат наблюдается при многократном удвоении фрагмента ДНК возбудителя. Как называется такой фрагмент?

A.Ампликон

B.Субстрат

C.Результат ПЦР

D.Часть молекулы ДНК

E. Копируемый фрагмент

13. Гинеколог назначил исследование на М. genitalium методом ПЦР через 2 месяца после проведенного лечения. Но пациентка самостоятельно сдала этот анализ через 1 неделю после окончания терапии и получила ответ: «М. genitalium – обнаружена». С каким ограничением метода ПЦР может быть связан этот результат?

A.Копированием ДНК убитого возбудителя

B.Денатурацией ДНК

C.Нестабильностью нуклеиновых кислот

D.Изменчивостью микроорганизмов

E.Перекрестным копированием

14.После пробоподготовки для проведения ПЦР врач-лаборант собирает реакционную смесь, добавляет обработанный биоматериал пациента и ставит в термоциклер, где происходит копирование и умножение копий ДНК возбудителя по заданной программе. Укажите, как называется этот этап ПЦР?

A.Детекция

B.Денатурация

C.Амплификация

D.Агрегация

E.Абсорбция

15.Уролог назначил пациенту обследование на урогенитальные инфекции методом ПЦР, предупредив, что это надо сделать до начала лечения. Что возможно определить методом ПЦР?

A.Жизнеспособность микроорганизмов

B.Наличие или отсутствие ДНК возбудителя

C.Морфологические свойства ДНК

D.Способность создавать комплекс антиген-антитело

39

E.Патогенетические особенности ДНК

16.В лабораторию детским урологом были направлены два мальчика 7 и 11 лет для обследования методом ПЦР (кровь, моча) на М. hominis и Ur. urealiticum. Мальчики занимаются плаванием. У обоих мальчиков жалобы на боли при мочеиспускании и покраснение головки полового члена. В результате обследования у них в моче была обнаружена только М. hominis, в крови данные микроорганизмы не обнаружены. Чем объяснить расхождение результатов?

A.Наиболее вероятным местом локализации возбудителя

B.Видом возбудителя и длительностью течения заболевания

C.Реакцией организма на возбудителя

D.Восприимчивостью возбудителя к основным красителям

E.Желанием пациента

17.Женщина 23 лет пришла на контрольное исследование через 1 неделю после окончания курса антибиотикотерапии по поводу хламидийной инфекции. Результат анализа положительный. Врач предположил, что результат мог быть ложноположительный и назначил дополнительный метод исследования, чтобы оценить жизнеспособность микроорганизма и сделать вывод о неэффективности проведенной терапии. Какой метод исследования целесообразно назначить в данном случае?

A.Микроскопический

B.Бактериологический

C.Молекулярно-биологический (ПЦР)

D.Прямую иммунофлюоресценцию (ПИФ)

E.Иммуноферментный

18.Врач с целью подбора патогенетической терапии при пневмании неясной этиологии назначил пациенту исследование соскоба из зева методом ПЦР на C. pneumoniae, т.к. данный метод обладает практически 100% специфичностью. Это обусловлено:

A.Подбором буфера для реакции

B.Изменением объема реакционной смеси

C.Копированием всей молекулы ДНК возбудителя

D.Копированием уникального фрагмента ДНК возбудителя

E.Квалификационными навыками персонала

19.Девочке 7 лет на основании клинического осмотра и обнаружении мононуклеаров в общем анализе крови был поставлен диагноз: инфекционный мононуклеоз. Для уточнения диагноза врач назначил исследование слюны ребенка на наличие ВЭБ. Каким методом необходимо выполнить исследование?

A.Микроскопическим

B.Бактериологическим

C.Молекулярно-биологическим (ПЦР)

D.Прямой иммунофлюоресценцией (ПИФ)

40

E.Иммуноферментным

20.Перед планированием беременности семейной паре врач назначил обследование на заболевания, передающиеся половым путем и рекомендовал в качестве наиболее чувствительного и специфического метода лабораторной диагностики использовать:

A.Микроскопический

B.Молекулярно-биологический (ПЦР)

C.Прямую иммунофлюоресценцию (ПИФ)

D.Иммуноферментный анализ

E.Бактериологический

21.Врач-лаборант выполняет постановку реакции микропреципитации с кардиолипиновым антигеном для выявления антител к Т. рallidum. Что является патофизиологической основой развития ответной иммунной реакции организма?

A.Внедрение антигена

B.Количество антигена

C.Выработка антител

D.Дифференциация лимфоцитов

E.Реактивность организма

22.В клинико-диагностическую лабораторию с целью прохождения медицинского осмотра направлена кровь пациента для серологической диагностики на наличие сифилитической инфекции. Какие из перечисленных методов серодиагностики наиболее часто используют в качестве скрининговых (отборочных) реакций при диагностике сифилиса?

A.ИФА

B.Реакцию микропреципитации

C.Иммунный блоттинг

D.РИФ

E.Агглютинации

23.У пациетки при профосмотре были обнаружены антитела к цитомегаловирусу. Клинических проявлений нет. К какому классу иммуноглобулинов относятся антитела, которые длительно (иногда годами) сохраняются в сыворотке крови переболевших?

A.IgG

B.IgM

C.IgA

D.IgD

E.IgE

24.У ребенка с клиническими проявлениями были обнаружены антитела к краснухе. При повторном обследовании через 2 недели данные антитела не обнаружились. Врач объяснил, что они появляются в остром периоде заболевания и относительно быстро исчезают. К какому классу иммуноглобулинов они принадлежат?

41

A.IgG

B.IgM

C.IgA

D.IgD

E.IgE

25.У пациента были обнаружены антитела к ВИЧ. Но инфекционист назначила дополнительное исследование на антитела к гликопротеинам оболочки вируса, белкам сердцевины и ферментам вируса для уточнения диагноза. Назовите метод, который использовался для определения антител к отдельным антигенам вируса.

A.ИФА

B.Биохимический

C.Иммунный блоттинг

D.Реакция склеивания комплемента

E.Метод радиальной диффузии

26.Беременной женщине поставили диагноз Хламидиоз. Какие методы исследования были использованы для подтверждения диагноза?

A.ИФА, ПЦР

B.Выделение чистой культуры хламидий

C.Темнопольная микроскопия

D.ИФА, бакпосев

E.Биологический метод на мышах

27.У больного выявлена агглютинация эритроцитов с цоликлоном анти-В и не было агглютинации с цоликлоном анти-А. Какая группа крови у пациента?

A.0 (1)

B.А (II)

C.В (III)

D.А1В (IV)

E.А2В (IV)

28.Больной 40 лет, житель сельской местности, в доме имелась дворовая собака свободного содержания. Заболел остро: возникла лихорадка до 39ºС, кашель, на фоне которого стали возникать приступы удушья. Наблюдались диспепсические расстройства, появились зудящие кожные высыпания. При обследовании была выявлена полилимфаденопатия, увеличение печени, сухие свистящие хрипы в легких. В крови: эозинофилия 18%, обнаружены суммарные Ig к T. canis. Какой диагностический титр антител для постановки диагноза токсокароз?

A.1:100

B.1:200

C.1:400

D.1:600

E. 1:800

29.Больной 33 лет с установленным диагнозом Хламидиоз прошел курс

42

лечения. Через 4 месяца повторно сдал кровь на антитела к C. trachomatis, но результат анализа вновь был положительный. Врач повторно назначил сдать антитела через полгода. Какая особенность данного возбудителя приводит к тому, что не всегда наблюдается полная излеченность от инфекции?

A.Наличие напряженного пожизненного иммунитета

B.Возможность персистенции возбудителя

C.Возможность специфической профилактики

D.Образование спор

E.Полиорганность поражения

30.В крови 20-летней беременной женщины обнаружены IgG к краснухе в количестве 120 МЕ/мл. В анамнезе она краснухой не болела, но была привита по возрасту. Чем обусловлена длительная циркуляция антител в организме человека после вакцинации или перенесенного заболевания?

A.Клетками памяти

B.Формированием нестерильного иммунитета

C.Клетками-киллерами

D.Системой мононуклеаров

E. Высоким уровнем фагоцитарной активности

43

ГЛАВА 2. КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА В ОРГАНИЗМЕ И ЛАБОРАТОРНАЯ ГЕМАТОЛОГИЯ

Гемостаз – это система организма, обеспечивающая, с одной стороны, сохранение крови в кровеносном русле в жидком агрегатном состоянии, а с другой – остановку кровотечения и предотвращение кровопотери при повреждении кровеносных сосудов. Процесс внутрисосудистого свертывания крови, или гемокоагуляции, происходит постоянно в течение всей жизни человека. В то же время его интенсивность бывает различной. Нарушения интенсивности внутрисосудистого свертывания крови приводят к развитию таких патологических проявлений как геморрагии, тромбозы и ДВС-синдром (диссеминированное внутрисосудистое свертывание).

Составляющие систему гемостаза компоненты условно можно разделить на морфологические и функциональные.

Морфологические компоненты системы гемостаза:

1.Сосудистая стенка.

2.Тромбоциты и клеточные элементы крови.

3.Плазменные компоненты – белки, пептиды и небелковые медиаторы гемостаза, цитокины, гормоны.

4.Костный мозг, печень, селезенка тоже могут рассматриваться, как компоненты системы гемостаза, поскольку в них синтезируются и пулируются тромбоциты и плазменные компоненты системы гемостаза.

Функциональные компоненты системы гемостаза:

1.Прокоагулянты (факторы свертывания крови).

2.Ингибиторы коагуляции, антикоагулянты.

3.Фибринолитики.

4.Ингибиторы фибринолиза.

Гемокоагуляция внутри сосудистого русла осуществляется при взаимодействии системы прокоагулянтов, формирующих фибрин, тромбоцитов и системы фибринолиза, которая регулирует величину формирующегося кровяного сгустка. Активированные тромбоциты и мембраны поврежденных клеток участвуют в формировании специфических комплексов, состоящих главным образом из белков – прокоагулянтов, которые и обеспечивают сам феномен свертывания крови.

Пять составляющих гемостатического процесса:

1.Локальная вазоконстрикция.

2.Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз (первичный, микроциркуляторный) – формирование тромбоцитарной пробки для быстрого закрытия поврежденного сосуда (микроциркулятоное русло).

44

3.Плазменный гемостаз (вторичный, коагуляционный, макроциркуляторный) – образование фибриновой сети, которая стабилизирует тромбоцитарную пробку.

4.Антикоагулянты (противосвертывающая система) – ингибируют факторы коагуляции для ограничения процесса в пространстве и предотвращения чрезмерного роста сгустка.

5.Фибринолиз – растворение фибринового сгустка и восстановление просвета сосуда.

Локальная вазоконстрикция

Высвобождающиеся из активированных клеток медиаторы обеспечивают быстрое (менее 60 с) локальное сужение сосудов:

•из тромбоцитов – серотонин, тромбоксан А2 (ТХ А2); фактор, активирующий тромбоциты (ФАТ, PAF);

•из эндотелиальных клеток – эндотелин-1 (ET-1), ангиотензин II (АТ II), PAF, ТХ А2.

Вазоконстрикция может сохраняться до 2 часов, она способствует сокращению размеров дефекта сосуда, открытию коллатеральных сосудов, что снижает давление крови в поврежденном участке.

Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз

Первичный гемостаз запускает все реакции гемостаза в капиллярах, венозных и артериальных сосудах до 100 мкм в диаметре.

Неповрежденный эндотелий является антикоагулянтной поверхностью, не привлекающей клетки крови и не активирующей свертывание. После активации или травмы эндотелий превращается в прокоагулянтную поверхность, приводящую к запуску гемокоагуляции.

При патологии наиболее часто реактивной поверхностью также могут являться:

•атеросклеротическая бляшка;

•дисфункциональный (поврежденный) эндотелий;

•искусственные клапаны сердца;

•сосудистые шунты.

Нормальные тромбоциты имеют дисковидную форму и в циркулирующей

крови перемещаются изолированно друг от друга, не вступая во взаимодействие с эндотелием сосудов. При повреждении сосудистой стенки тромбоциты с помощью фактора Виллебранда (vWF) прилипают к субэндотелиальным структурам – коллагеновым волокнам, миофибриллам, миоцитам, и при этом приобретают сферическую форму. Эта стадия обозначается термином «адгезия тромбоцитов» (рис. 11).

Через 30–60 сек адгезированные тромбоциты выделяют в окружающую среду аденозиндифосфат (АДФ), серотонин, адреналин, фибриноген, фактор -4 тромбоцитов (F4-Pt) и ряд других биологически активных веществ (БАВ). Происходит стимулирование агрегации тромбоцитов, под которой

45

подразумевается их слипание друг с другом. При этом освобождение БАВ из тромбоцитов усиливается. Этот феномен обозначается как «реакция освобождения». Наиболее сильными активаторами тромбоцитов являются коллаген и тромбин, кроме того, АДФ, серотонин, PAF, ТХ А2, адреналин.

Рис. 11. Адгезия и агрегация тромбоцитов (ресурсы сети Интернет)

Важную роль в агрегации выполняют рецепторы на поверхности тромбоцита – рецепторы GP IIb-IIIa, лигандами которого являются фибриноген, фибрин, vWF (именно с этим фактором происходит связывание псевдоподий тромбоцитов с коллагеновыми волокнами) (рис. 12).

Рис. 12. Механизм агрегации тромбоцитов (ресурсы сети Интернет)

Далее образуются фибриногеновые мостики между тромбоцитами. В результате происходит быстрое образование рыхлой тромбоцитарной пробки, которая обеспечивает первичный гемостаз, но является нестойкой и может быть разрушена. В связи с этим данную фазу принято называть обратимой агрегацией тромбоцитов. Благодаря лавинообразному нарастанию концентрации агрегатов, обратимая фаза агрегации тромбоцитов переходит в

46

необратимую. В этом существенную роль играет тромбин, образующийся в результате активации плазменных факторов свертывания крови. При разрушении мембран тромбоцитов создаются условия для объединения тромбоцитарных агрегатов и уплотнения полученного сгустка. Этот феномен получил название ретракции кровяного сгустка.

Для остановки кровотечения в капиллярах «хватает работы» только первичного гемостаза. За счет низкого тока крови в микроциркуляторном русле достаточно тромбоцитарной пробки.

Плазменный гемостаз

Тромбоцитарная пробка непрочная и будет разрушаться, если не стабилизируется фибриновым каркасом, особенно в сосудах среднего и крупного калибра. Одновременно с тромбоцитами в процессе гемокоагуляции участвуют факторы свертывания крови (прокоагулянты) – группа белков и ионы кальция, которые в процессе своего взаимодействия приводят к образованию фибрина. Именно фибрин является основой как гемостатического, так и тромботического эффекта.

Прокоагулянты обозначаются римскими цифрами:

ф.I – фибриноген; ф.II – протромбин;

ф.III – тканевой фактор (тромбопластин); ф.IV – ионы кальция;

ф.V–VI – проакцелерин-акцелерин; ф.VII – проконвертин;

ф.VIII – антигемофильный глобулин; ф.IX – Кристмас-фактор;

ф.X – фактор Стюарта;

ф.XI – плазменный предшественник тромбопластина; ф.XII – фактор Хагемана;

ф.XIII – фибринстабилизирующий фактор.

Общепринятым в настоящее время является использование цифрового обозначения прокоагулянтов, кроме тканевого фактора, ионов кальция, фибриногена и протромбина.

Кроме указанных факторов в процессе фибринообразования принимают участие прекалликреин, обозначаемый так же как фактор Флетчера, и кининоген высокого молекулярного веса, называемый фактором Фитцжеральда.

В основном, прокоагулянты, антикоагулянты и белки системы фибринолиза синтезируются в печени. Факторы ф.II, ф.VII, ф.IX, ф.X зависят от присутствия витамина К, без которого они не могут связываться с фосфолипидной поверхностью.

47

Три фазы коагуляционного гемостаза

Первая фаза – образование протромбиназы. Это самая длительная фаза.

Она включает взаимодействие целого ряда плазменных факторов, и проходит по двум путям: внутреннему и внешнему. Во внешнем пути участвует меньшее количество факторов. Конечным этапом первой фазы гемокоагуляции по обоим путям является образование активной протромбиназы (рис. 13).

При активации по внешнему пути свертывания крови в кровоток поступает ф.III, образующийся в результате разрушения клеток (травмы и операции, ожоги, сепсис, роды и т.д.). Соединение тканевого тромбопластина с ф.VII и ионами кальция приводит к активации протромбиназы. Время, необходимое на образование фибрина при попадании в кровоток тканевого тромбопластина, составляет менее 15 секунд.

По внутреннему пути активация более сложная и длительная. ф.XII может активироваться контактной поверхностью (стекло, металл), иммунными комплексами, адреналином, коллагеном, и т.д. Ф.XIIа (активированный) запускает целый каскад активаций, происходящих на фосфолипидных матрицах с участием ионов кальция. В этом каскаде каждый активированный фактор приводит к активации следующего – ф.XI, ф.IX, ф.VIII, ф.V, ф.X. Внутренний путь активации занимает 3–5 минут.

Рис. 13. Схема плазменного гемостаза (ресурсы сети Интернет)

48

Вторая фаза – образование тромбина. Эта фаза осуществляется при взаимодействии протромбиназного комплекса с протромбином в присутствии ф.V, ф.VII, когда происходит образование активного фермента – тромбина.

Третья фаза – образование фибрина. При взаимодействии тромбина с фибриногеном, когда от последнего отщепляются фрагменты (фибринопептиды А и В), и оставшиеся фрагменты молекулы фибриногена склеиваются между собой в линейную последовательность (растворимые фибрин-мономерные комплексы – РФМК, их нарастание в плазме может свидетельствовать о происходящем процессе образования фибрина). Линейные молекулы соединяются между собой, образуя сетчатую структуру (фибрин-полимерные комплексы или «растворимый» фибрин). Под действием ф.XIII происходит уплотнение сетчатого фибринового сгустка и превращение его в «нерастворимый» фибрин. Одновременно в сгустке оказываются тромбоциты, эритроциты и лейкоциты, вовлекаемые в тромб нитями фибрина. В конечном итоге образуется «красный кровяной» тромб, осуществляющий остановку кровотечений. Далее тромб подвергается фибринолизу, параллельно с этим в стенке сосуда развиваются репаративные процессы, завершающиеся полным восстановлением целостности сосудистой стенки.

Антикоагулянтная система

Физиологические антикоагулянты инактивируют факторы свертывания. Важную роль играют антитромбин III (AT III), протеины С и S, которые синтезируются в печени и постоянно циркулируют в кровотоке.

АТ III является главным антикоагулянтом, поскольку на его долю приходится до 80% всей антикоагулянтной активности плазмы. Инактивация тромбина происходит под влиянием АТ III в комплексе с гепарином (кофактор AT III). AT III обладает способностью ингибировать как тромбин, так и ф.XII, ф.XI, ф.IX, ф.X и ф.VII. В процессе свертывания крови AT III расходуется очень быстро, так как на инактивацию каждой молекулы любого из перечисленных выше факторов свертывания утилизируется по одной молекуле AT III. При снижении AT III до уровня 30–50% и ниже резко возрастает риск тромбозов и тромбоэмболии. Гепарин в отсутствии или при дефиците AT III не оказывает антикоагулянтного действия.

Когда тромбин вымывается потоком крови из места образования и контактирует с неповрежденным эндотелием, он нейтрализуется АТ III, связанным с гликопротеинами стенки сосуда, имеющими гепариноподобные структуры. Антикоагулянтные свойства гликопротеинов сосудистой выстилки могут нарушаться активированными нейтрофилами, что является одним из механизмов тромбоза при воспалении и сепсисе.

Еще одна группа веществ – антикоагулянтов – система протеинов С и S. Протеин С, его рецептор на эндотелиальных клетках – тромбомодулин, и протеин S инактивируют ф.V и ф.VIII. Если вымываемый из места повреждения тромбин не инактивирован АТ III, то он может связаться с

49

тромбомодулином и активировать протеин С, который расщепляет ф.V и

ф.VIII.

Протеин С обладает не только антикоагулянтной, но и противовоспалительной активностью – снижает синтез цитокинов, экспрессию адгезивных молекул, предотвращает апоптоз эндотелия.

Фибринолиз

Фибринолитическая система состоит из профермента плазминогена, ферментов, превращающих плазминоген в активную форму – плазмин (фермент, непосредственно расщепляющий фибрин), и системы ингибиторов, контролирующих как активацию плазминогена, так и процесс лизиса фибрина. После выполнения гемостатической функции и регенерации ткани фибрин должен быть удален для восстановления нормального кровотока. Система фибринолиза расщепляет фибрин на продукты деградации фибрина (ПДФ), которые обозначаются как маркеры постоянно происходящего внутри сосудистого русла процесса свертывания крови различной степени интенсивности. Одним из таких маркеров является D-димер, который дает информацию о формировании в кровяном русле фибрина, укрепленного действием ф.ХIII.

Тканевой активатор плазминогена синтезируется эндотелиальными клетками. Активатор плазминогена урокиназного типа синтезируется эндотелиальными клетками, фибробластами, макрофагами, эпителиальными и некоторыми другими клетками. Активация физиологического фибринолиза возможна так же посредством ф.XII. Фибринолиз в норме идет только в тромбах. Процесс начинается сразу же после повреждения сосуда, растворение тромба и реканализация сосуда могут занимать 7–10 сут.

Нефизиологическими активаторами плазминогена являются стрептокиназа гемолитического стрептококка и стафилокиназа стафилококка. Эти вещества и их высокоочищенные формы применяются для лечения острых тромбозов.

Так же, как и система свертывания крови, система фибринолиза ограничена ингибиторами. А2-антиплазмин, синтезируемый в печени и тромбоцитах, является наиболее мобильным ингибитором фибринолиза. Ингибитор активатора плазминогена 1 образуется в эндотелиоцитах и печени и относится к белкам острой фазы. Ингибитор активатора плазминогена 2 образуется в плаценте и макрофагах.

Оценка сосудисто-тромбоцитарного гемостаза

Измерение времени кровотечения. Удлинение времени кровотечения говорит о дефекте тромбоцитарного звена гемокоагуляции в результате уменьшения количества тромбоцитов или при дефекте их качественных характеристик – способности к адгезии, агрегации, реакции высвобождения или ретракции кровяного сгустка. При удлинении времени кровотечения необходимо определить количество тромбоцитов в крови. При отсутствии

50

тромбоцитопении следует констатировать тромбоцитопатию и производить специальные исследования функциональной активности тромбоцитов.

Метод Дюке (Duke). При этом методе требуется осуществить прокол кожи в мочке уха, так как именно здесь толщина кожи в подавляющем большинстве случаев одинакова. Исключения составляют лица, имевшие рубцевания мочек ушей вследствие нагноений после процедур по формированию отверстий для ношения сережек. Одновременно с проколом кожи включают секундомер, а капельку крови снимают фильтровальной бумажкой сразу же после ее появления. Как только капля крови не появляется, секундомер выключают и фиксируют продолжительность имевшего место кровотечения. Длительность кровотечения по Duke составляет 2–4 минуты.

Метод Айви (Ivy) более стандартизирован и широко применяется за рубежом. Манжету от аппарата для измерения АД накладывают на плечо, и поддерживают в ней давление в 40 мм рт.ст. После чего на ладонной поверхности верхней трети предплечья делают скарификатором поперечные насечки глубиной 1,5–2,0 мм, фильтровальной бумагой осторожно снимают капли крови через каждые 15–30 с. В норме через 3–4 мин размер пятна крови на бумаге начинает уменьшаться, и через 6–8 мин истечение крови прекращается (рис. 14).

Рис. 14. Метод Ivy (ресурсы сети Интернет)

Подсчет количества тромбоцитов. В настоящее время используют определение количества тромбоцитов и их распределение по величине (гистограмма) с помощью гематологических анализаторов. Эти аппараты точны и позволяют проводить экспресс-диагностику (определения выполняются за 1 мин).

Развернутый анализ тромбоцитов на анализаторе позволяет определить такие показатели:

РLТ – количество тромбоцитов. Норма: 150–400×109/л.

MPV – средний объем тромбоцитов. Норма: 8,6–8,9 фл у детей 1–5 лет; 9,0–9,4 фл у взрослых; 9,5–10,6 фл у людей старше 70 лет.

51

PDV – ширина распределения тромбоцитов по объему отражает степень анизоцитоза тромбоцитов. Норма: 14–18%.

РСТ – тромбокрит – доля объема цельной крови, занимаемая тромбоцитами (аналогичен Hct). Норма: 0,15–0,40%.

Снижение числа тромбоцитов (<150 Г/л) может наблюдаться при следующих состояниях или терапевтических воздействиях:

•острый ДВС-синдром;

•острый лейкоз и миелодиспластические синдромы;

•гипо- и апластические анемии;

•нарушение образования в организме тромбоцитопоэтина;

•химиотерапия и лучевая терапия;

•тромботическая тромбоцитопеническая пурпура и гемолитикоуремический синдром;

•спленомегалия и гепатолиенальный синдром;

•эклампсия и преэклампсия;

•экстракорпоральное кровообращение;

•гемодиализ у больных с хронической почечной недостаточностью;

•гемосорбция;

•интенсивная трансфузионная терапия;

•пароксизмальная ночная гемоглобинурия;

•иммунные формы патологии (системная красная волчанка и другие коллагенозы, антифосфолипидный синдром, иммунная тромбоцитопеническая пурпура);

•гепарин-индуцированная тромбоцитопения.

Вслучае наличия ЭДТА-зависимой псевдотромбоцитопении (лабораторный феномен) возможно ошибочное определение тромбоцитопении.

Повышение числа тромбоцитов (>400 Г/л) наблюдается в случаях:

•инфекционных заболеваний, чаще всего бактериальных, реже вирусных, паразитарных и грибковых;

•мегакариоцитарные и миелолейкозы;

•эритремии;

•спленэктомии (через 1–3 недели);

•внутриполостных кровоизлияний после оперативных вмешательств;

•хронических воспалений (колит, васкулит, ревматоидный артрит и т.д.);

•переломов крупных костей (бедренной, плечевой, костей таза);

•спустя 7–10 дней от начала подострого токсико-инфекционного ДВС-синдрома;

•перенесенного острого кровотечения;

•злокачественных новообразований (предвестник опухоли легкого, поджелудочной железы).

52

Исследование функциональных свойств тромбоцитов. Нормальное количество тромбоцитов может не обеспечивать полноценный гемостаз при нарушении их функциональных свойств – тромбоцитопатиях.

Поэтому в обязательном порядке исследуют функциональные свойства тромбоцитов, способность к спонтанной и индуцированной различными индукторами агрегации: тромбином, АДФ, коллагеном, ристоцетином, адреналином и т.д. Для исследования функциональных свойств тромбоцитов используют плазму богатую тромбоцитами (рис. 15).

Рис. 15. Агрегации тромбоцитов в пробирке (ресурсы сети Интернет)

Преимущество имеет графическая регистрация процесса на агрегометре,

однако выполнение исследований требует большого количества плазмы. Результаты этих исследований позволяют диагностировать тромбоцитопатии, нозологическая принадлежность которых обусловлена характерным нарушением тех или иных функциональных свойств тромбоцитов или их сочетанием (рис. 16).

Рис. 16. Агрегация тромбоцитов под воздействием малых доз АДФ (ресурсы сети Интернет)

53

Повышение агрегационной активности тромбоцитов характерно для:

•претромботических состояний;

•идиопатического тромбоцитоза;

•тромбозов;

•инфарктов органов;

•атеросклероза;

•васкулита;

•беременности.

Снижение агрегационной активности тромбоцитов наблюдается при первичных и симптоматических тромбоцитопатиях, лечении антиагрегантами (табл. 2, рис. 17).

Таблица 2

Агрегаторгамма

Рис. 17. Кривые агрегации тромбоцитов (ресурсы сети Интернет)

Методы исследования коагуляционного гемостаза

При исследовании коагуляционного (плазменного) гемостаза используют ряд тестов. Нормы для тестов могут менятся в зависимости от фирмыпроизводителя и указываются в бланках ответа.

АЧТВ – активированное частичное тромбопластиновое время.

Принцип метода АЧТВ состоит в определении времени свертывания декальцинированной плазмы после добавления к ней каолин-кефалин- кальциевой смеси. АЧТВ оценивает способность формировать фибрин по внутреннему пути коагуляционного гемостаза посредством последовательного взаимодействия ф.XII, ф.XI, ф.IX, ф.VIII, ф.X, ф.V, ф.II, ф.I.

Исследование проводят с помощью коагулометра (клоттинговые методы основаны на фиксации времени образования фибриновой нити).

54

Удлинение АЧТВ может быть вызвано:

•врожденным (гемофилия) или приобретенным недостатком факторов:

ф.XII, ф.XI, ф.VIII, ф.IX, ф.V, ф.X, ф.II, ф.I;

•наличием антител к факторам свертывания;

•болезнью Виллебранда (более тяжелые формы);

•антифосфолипидным синдромом, в том числе и антикоагулянта волчаночного типа;

•ДВС II и III фазы;

•дисфибриногенемией;

•передозировкой кумариновых препаратов;

•попаданием гепарина в пробу крови.

Укорочение АЧТВ свидетельствует об активации процесса свертывания крови, гиперкоагуляции и опасности возникновения тромбозов (например, при сепсисе, ожогах, обширных раневых поверхностях, беременности, канцероматозе, I фазе ДВС-синдрома).

АЧТВ применяют для скрининговой оценки состояния системы гемокоагуляции, в том числе и перед операциями; он обязателен для контроля лечения нефракционированным гепарином. Дозу гепарина подбирают таким образом, чтобы АЧТВ удлинялось в 1,5–2,5 раза, в зависимости от клинических симптомов больного и терапевтической задачи.

АЧТВ является основным исследованием для скрининговой оценки функционирования системы гемостаза.

ПВ – протромбиновое время. В основе измерения протромбинового времени лежит определение времени формирования фибринового сгустка в исследуемой плазме после добавления к ней тромбопластин-кальциевой смеси. Эта смесь активирует ф.VII и обеспечивает функционирование внешнего каскада формирования фибрина.

Исследование проводят с помощью коагулометра.

Удлинение протромбинового времени может быть при:

•врожденном или приобретенном дефиците факторов: ф.VII, ф.X, ф.V,

ф.II, ф.I;

•дефиците витамина К;

•заболеваниях печени;

•терапии антикоагулянтами непрямого действия;

•наличии ингибиторов к указанным факторам свертывания крови;

•II и III фазах ДВС-синдрома.

Протромбиновый тест применяют для оценки состояния системы

гемокоагуляции, контроля терапии антикоагулянтами непрямого действия и определения активности ф.VII.

Измеряемый в тесте показатель – протромбиновое время может выражаться в секундах или в процентах протромбина по Квику (Quick).

Контроль лечения непрямыми антикоагулянтами – антагонистами витамина К необходимо производить определением показателя

55

Международного Нормализованного Отношения (МНО). Показатель МНО было предложено использовать для стандартизации тромбопластина, т.к. он имеет различную чувствительность к недостатку факторов внешнего пути гемокоагуляции (прежде всего ф.VII). Для этого требуется знать международный индекс чувствительности (МИЧ) того образца тромбопластина, с помощью которого выполняют исследование (указывается в тест-системе).

МНО рассчитывают по формуле:

МНО = (ПВ пациента/ПВ норма)МИЧ Укорочение ПВ свидетельствует об активации процесса свертывания

крови, гиперкоагуляции и опасности возникновения тромбозов (например, при сепсисе, ожогах, обширных раневых поверхностях, беременности, канцероматозе, I фазе ДВС-синдрома).

ТВ – тромбиновое время. Данный тест, отражающий взаимодействие тромбина с фибриногеном, проводят с помощью коагулометра. При добавлении тромбина к исследуемой плазме измеряют время от момента добавления реагента до образования сгустка.

Удлинение тромбинового времени может быть следствием уменьшения количества фибриногена в плазме, нарушения структуры фибриногена (дисфибриногенемия), наличия в плазме гепарина или его фракций, а также при наличии в плазме иных ингибиторов тромбина, в том числе ПДФ или фибриногена.

Укорочение тромбинового времени свидетельствует о риске тромбозов.

Фибриноген. Наиболее распространенным является метод определения фибриногена по Клауссу (Clauss). Сущность метода заключается во взаимодействии тромбина, добавленного в повышенной концентрации с фибриногеном разведенной плазмы обследуемого (для исключения действия антитромбинов). В этих условиях время реакции образования сгустка зависит только от количества фибриногена. Определение фибриногена по Клауссу осуществляют с помощью коагулометра.

Увеличение количества фибриногена наблюдается при острофазовых реакциях (воспаление, инфекции, травмы, ожоги, послеоперационный период); болезнях соединительной ткани; злокачественных новообразованиях. Уменьшение возникает при гиперпотреблении – образовании микросгустков (ДВС, травмы, ожоги, шок, тяжелый токсикоз), действии фибринолитиков; уменьшении синтеза – тяжелые поражения печени.

РФМК – растворимые фибрин-мономерные комплексы. При патологиях, характеризующихся активацией свертывания крови, происходит расширение пула фибриногена, в результате чего увеличивается количество РФМК. Они образуются в крови в результате воздействия тромбина на фибриноген. Определение РФМК производят с помощью ортофенантролинового теста.

56

Повышение содержания РФМК наблюдается при:

•активации внутрисосудистого свертывания крови (тромбофилии, ДВС-синдром, тромбоз глубоких вен, эмболии легочной артерии);

•лечении антикоагулянтами;

•физическом и психологическом стрессе;

•нормально протекающей беременности;

•в период новорожденности.

Определение фибринолитической активности крови. D-димер.

Определения D-димера позволяет помочь в дифференциальной диагностике тромбоэмболизма в трудных диагностических случаях при малой и средней клинической вероятности тромбоза глубоких вен и/или тромбоэмболии легочной артерии. Отсутствие повышения D-димера дает возможность исключать эти заболевания. Определение D-димера совместно с оценкой клинической картины позволяет почти на 30% снизить назначение сложных и дорогостоящих инструментальных обследований больного.

Оценка уровня D-димера в качестве показателя эффективности антитромботической терапии в настоящее время находится в стадии изучения. Следует иметь в виду, что у больных со старыми структурированными тромбами уровень D-димера может быть в пределах нормы. В связи с этим для принятия решения о дальнейшей тактике лечения больного результаты определения данного теста должны сопоставляться с оценкой клинической картины и данными визуализации.

Лабораторное мониторирование терапии антикоагулянтами

Препараты, понижающие свертываемость крови, представлены следующими группами:

1.Дезагреганты (аспирин, плавикс и др.).

2.Антикоагулянты:

•прямые – нефракционный гепарин (НФГ), низкомолекулярные гепарины (НМГ);

•непрямые – антикоагулянты непрямого действия (АНД).

Дезагреганты – препараты, ингибирующие агрегацию тромбоцитов, следовательно, в процессе их применения необходим контроль функции тромбоцитов на агрегометре.

Точкой приложения НФГ является инактивация ф.IIa, контроль его применения осуществляется при помощи АЧТВ. Кроме этого, есть возможность отследить конечный итог применения высокомолекулярного гепарина определением РФМК, как маркера тромбинемии. При удлиннении АЧТВ, но при высоких цифрах РФМК риск тромбообразования остается. Гепарин может вызывать тромбоцитопению, поэтому обязателен контроль количества тромбоцитов.

НМГ в терапевтических дозах не влияют на значение АЧТВ, и в этом случае для контроля достаточности антикоагулянтной терапии следует использовать определение концентрации РФМК и анти-ф.Xa.

57

Принцип действия непрямых антикоагулянтов заключается в угнетении синтеза витамина К. Основным и единственным достоверным методом оценки применения непрямых антикоагулянтов является измерение ПВ с последующим расчетом МНО.

При подборе дозы антикоагулянтов ориентируются на терапевтические пределы МНО 2,0–3,0. Как правило, наиболее оптимальным значением при терапии считается МНО=2,3–2,4. Но это определяется состоянием пациента.

При назначении непрямых антикоагулянтов необходимо соблюдать специфическую диету, исключающую продукты, содержащие витамин К (например, зеленый чай, шпинат, яйца и т.д.). Стабилизация МНО происходит в течение 6 недель от начала приема препарата.

Необходимая частота определения МНО по протромбиновому тесту: в

начале лечения ежедневно с показателем АЧТВ; при стабильном уровне МНО еженедельно, затем ежемесячно.

Важной задачей лабораторной диагностики системы гемостаза является распознание ДВС-синдрома, для которого характерно фазность изменений лабораторных показателей. В фазу гиперкоагуляции – АЧТВ укорочено, а РФМК высокие, в переходную фазу – АЧТВ начинает удлиняться или нормализоваться, а РФМК остаются высокими, в фазу гипокоагуляции – АЧТВ удлинено, а РФМК ниже нормы.

Главными тестами при исследовании ДВС-синдрома являются:

количество тромбоцитов в крови, РФМК, D-димеры, активность АТ III. При этом выявляется чаще тромбоцитопения, повышение РФМК и D-димеров, активность АТ III менее 70%.

ЛАБОРАТОРНАЯ ГЕМАТОЛОГИЯ

Клинический анализ крови – один из самых распространенных и важных лабораторных анализов. Изменения в этом анализе отражают процессы, происходящие в организме в ответ на воздействие физиологических и патологических факторов, но они не всегда специфичны. Как известно, одним из важнейших физиологических свойств крови является реактивность – способность отвечать на изменения, происшедшие в организме, изменением своего качественного и количественного состава. Поэтому анализ результатов гематологического исследования крови характеризует физиологическое состояние организма в данный момент и составляет неотъемлемое звено в диагностическом процессе и последующем мониторинге на фоне проводимой терапии. Клинический анализ крови широко используется как первичный метод обследования при обращении к специалистам любого профиля, для диспансеризации и контроля проводимого лечения. Особое значение анализ крови имеет при диагностике анемий и системных заболеваний крови.

В качестве антикоагулянта в вакуумных пробирках для гематологических исследований цельной крови используют калиевую или натриевую соли ЭДТА. Антикоагулянт ЭДТА наносят распылением на внутреннюю поверхность

58

пластиковых пробирок. Для обеспечения правильного соотношения кровь/антикоагулянт пробирка с ЭДТА должна быть заполнена точно до указанного объема. Недостаток ЭДТА в пробе приводит к ее коагуляции, а избыточная концентрация ведет к сморщиванию клеток крови и искажению таких клинических показателей, как гематокрит, размер клеток и т.д. Сразу после взятия крови в вакуумную пробирку с ЭДТА ее необходимо тщательно перемешать, переворачивая 8–10 раз.

Гематологический анализатор

Клинический анализ крови, выполненный с помощью гематологического анализатора, позволяет оценивать состояние эритропоэза, а также функции эритроцитов периферической крови для характеристики процессов тканевого дыхания и дифференциальной диагностики анемических синдромов. Лейкоцитарный состав крови, физиологическое состояние ядерных клеток, свойства их мембран характеризуют функциональную активность неспецифического звена иммунитета и отражают ход воспалительного процесса.

Существует четыре типа гематологических анализаторов крови, заточенных под конкретный вид исследований, на которых специфицируется лаборатория:

1.Первый тип. Анализирует до восьми показателей, не проводя деление лейкоцитов на субпопуляции.

2.Второй тип (3-DIFF). Анализирует среднее количество показателей (до двадцати) и имеет аппаратную возможность разделения лейкоцитов на три субпопуляции.

3.Третий тип (5-DIFF). Работает с максимальной цифрой в 28 показателей и способен делить лейкоциты на пять популяций.

4.Четвертый тип. Способен обрабатывать до 40 показателей и работать с дифференцировкой ретикулоцитов, что обеспечивается подключением расширительного модуля.

Главный принцип работы гематологического анализатора –

кондуктометрический – основан на оценке объема клеток. Этот метод базируется на эффекте изменения электрического сопротивления микроотверстия (трансдьюсера, апертуры) при прохождении через него клетки крови. Величина изменения сопротивления пропорциональна объему клетки. Это позволяет различать тромбоциты и эритроциты при их одновременном подсчете. Для подсчета лейкоцитов предварительно производится лизис эритроцитов. Устройство трансдьюсера во всех современных гематологических анализаторах практически одинаковое.

Концентрация клеток определяется как отношение числа подсчитанных клеток к объему разведения пробы, которое прошло через трасдьюсер. Клетка крови во взвешенном растворе движется и проходит через отверстие. Сопротивление между электродами возрастает и вызывает увеличение напряжения. Амплитуда импульсов напряжения, измеряемая в десятых долях

59

микровольта, пропорциональна объему клетки. Усиление импульса происходит за счет малошумных усилителей, которые не допускают изменения формы импульса. На выходе расположен конденсатор, пропускающий импульсы с интервалом 50 мс. Промежуток соответствует времени прохождения одной клетки через отверстие (рис. 18). Импульсы поступают в реальном времени, обрабатываются и анализируются микропроцессором. В результате получают гистограммы распределения трех типов клеток: тромбоцитов, лейкоцитов и эритроцитов.

Рис. 18. Принцип работы гематологического анализатора (ресурсы сети Интернет)

Каждый гематологический анализатор предназначен для определенной реагентной системы.

Основные ее компоненты:

•лизирующий раствор;

•изотонический разбавитель;

•промывающий раствор для обработки после пробы;

•раствор для глубокой очистки.

После ввода пробы крови в анализатор внутри прибора выполняется ряд процедур.

На первом этапе осуществляется приготовление двух разведений введенной пробы крови: первое разведение – для подсчета концентрации лейкоцитов (в нем же после лизиса эритроцитов подсчитывается концентрация гемоглобина), и второе разведение – для подсчета концентрации эритроцитов и тромбоцитов. Первое разведение крови получается путем дозирования цельной крови (обычно 10–20 мкл) и изотонического разбавителя (5–10 мл) с последующим добавлением лизирующего раствора, который разрушает эритроциты и преобразует все формы гемоглобина к одной форме. Второе разведение крови получается путем дозирования первого разведения крови

60

(обычно 50–100 мкл) (до того, как в него добавляют лизирующий раствор) и изотонического разбавителя (5–10 мл).

На втором этапе анализатор определяет концентрации клеток крови в приготовленных разведениях, анализирует индивидуальные характеристики клеток крови: объем, свойства пропускания и рассеяния света; измеряет концентрацию производной формы гемоглобина. Для этого часть первого разведения крови по магистралям анализатора поступает в специальное устройство, которое подсчитывает лейкоциты, другая часть первого разведения поступает в проточную кювету гемоглобинометра, а второе разведение крови поступает в устройство, которое подсчитывает эритроциты и тромбоциты. Для расчета концентраций клеток при их подсчете измеряется объем разведения крови, прошедшего через устройство подсчета клеток.

На третьем этапе прибор выполняет комплекс вычислений, в результате которых получаются конечные данные анализа, после чего выводит на дисплей и на печать эти данные.

Оценка эритроцитарного звена

Оценка эритроцитарных индексов позволяет получить представление о характеристиках эритроцитов, что очень важно для дифференциальной диагностики анемии. Эритроцитарные индексы зачастую быстро реагируют на лечение анемий, и могут также использоваться для оценки эффективности терапии.

Результат анализа представляется пользователю в виде протокола (табл. 3). Помимо паспортных данных в протоколе указаны полученные результаты с аббревиатурой показателей и графические изображения гистограмм.

Увеличение количества эритроцитов может иметь реактивный (вторичный, симптоматический) генез. Чаще всего он развивается вследствие гиперпродукции эритропоэтина в ответ на тканевую гипоксию, причины которой могут быть самые различные. Такие эритроцитозы могут быть транзиторными и сопровождаются невысоким ретикулоцитозом.

Гематокрит относится к эритроцитарным параметрам и отражает отношение объема эритроцитов к объему плазмы. Показатель позволяет оценивать реологические свойства крови и интерпретировать колебания объема циркулирующей крови (ОЦК).

MCV. Показатель MCV имеет диагностическое значение при оценке микро-, нормо- и макроцитоза. MCV <75 фл свидетельствует о микроцитозе

(железодефицитная анемия (ЖДА), сидеробластные анемии, талассемия, анемии при хронических заболеваниях и злокачественных опухолях, системные заболевания, гемобластозы).

MCV в пределах 75–95 фл при анемиях свидетельствует о нормоцитарном характере анемии (ранние стадии ЖДА, острые постгеморрагические анемии, гемолитические анемии, анемии при гемобластозах и метастазировании опухолей в костный мозг, анемии хронических заболеваний).

61

MCV >95 фл свидетельствует о макроцитозе эритроцитов. Среди макроцитарных анемий наибольшую группу составляют фолиево- и В12дефицитные анемии. Макроцитоз может наблюдаться при аутоиммунных гемолитических анемиях, апластических анемиях, остром эритромиелозе, хронических миелопролиферативных лейкозах (ХМЛ) и на фоне лечения цитостатическими препаратами.

Макроцитоз эритроцитов без анемии может наблюдаться при диффузном поражении печени, алкоголизме, у лиц после спленэктомии, понижении функции щитовидной железы.

В то же время необходимо иметь в виду что MCV – средний показатель объема всей популяции эритроцитов, может иметь нормальное значение при наличии у пациента, одновременно выраженного макро- и микроцитоза, большом количестве аномальных эритроцитов (например, при серповидноклеточной анемии, микросфероцитозе, наличии шистоцитов, выраженном пойкилоцитозе).

62

Для оценки анизоцитоза и представления о размерах эритроцитов в популяции используют три показателя: MCV, RDW и гистограмму распределения эритроцитов по ширине. Распределение всех эритроцитов по ширине в абсолютных числах отображается на гистограмме (рис. 19). Кривая распределения в норме – мономодальная и отражает превалирование нормальных эритроцитов при небольшом присутствии макро- и микроцитов.

Рис. 19. Эритроцитарная гистограмма в норме (фото кафедры трансплантологии и клинической лабораторной диагностики ГОО ВПО ДОННМУ ИМ.М.ГОРЬКОГО)

Деформация кривой отражает наличие или преобладание клеток иного размера. Например, появление второй моды в области макроцитов, как правило, является признаком предшествующей кровопотери и последующей за ней массивной регенерации клеток более крупного размера (ретикулоцитов) (рис. 20).

Рис. 20. Бимодальная эритроцитарная гистограмма при появлении ретикулоцитов после кровопотери (фото кафедры трансплантологии и клинической лабораторной диагностики ГОО ВПО ДОННМУ ИМ.М.ГОРЬКОГО)

Физиологический анизоцитоз обеспечивается постоянным изменением размера клетки в течение жизни. Молодые клетки, поступающие в периферический кровоток, иногда достигают 10 мкм (в том числе, ретикулоциты). В течение жизни эритроцита происходит необратимое уменьшение его поверхности (до 6 мкм) в результате процесса микровезикуляции. Поврежденный участок мембраны выпячивается наружу в виде микровезикулы и слущивается. Поэтому о «возрасте» клетки можно судить по диаметру (степени его уменьшения).

У каждого конкретного пациента при отсутствии патологии со стороны кроветворения MCV является довольно стабильным показателем. Изменения

63

MCV могут дать полезную информацию о различных нарушениях в организме как связанных непосредственно с эритроцитами, так и общего характера.

Например, активация процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) при различных патологических состояниях приводит к увеличению очагов поврежденной мембраны и усилению процессов микровезикуляции. Также микроцитоз описан при хроническом вирусоносительстве. В то же время, изменение MCV может быть отражением сдвига водно-электролитного баланса. Повышенное значение MCV свидетельствует о гипотоническом характере нарушений водно-электролитного баланса, тогда как понижение – о гипертоническом характере.

Информативным показателем анизоцитоза эритроцитов считается RDW-CV. Гематологическим анализатором анизоцитоз улавливается значительно быстрее, чем при визуальном просмотре мазка крови.

Норма RDW-CV свидетельствует о наличии в данной пробе гомогенной по объему популяции эритроцитов (макро-, микро - или нормоцитов).

Повышение RDW-CV >15% указывает на присутствие в пробе гетерогенных клеток (анизоцитоз смешанного характера).

RDW-CV необходимо оценивать только параллельно с анализом гистограммы эритроцитов и оценкой морфологии эритроцитов в мазках крови. В большинстве случаев небольшое снижение этого показателя считается нормой. Анализатор может показывать либо нормальное значение RDW-CV, либо повышенное. Если же показатель снижен значительно, необходимо провести дополнительное исследование, чтобы выяснить причину, т.к. такие результаты свидетельствуют о неправильной работе анализатора.

RDW-CV – важный дополнительный критерий для диагностики анемий и динамического наблюдения за результатами лечения. Увеличение процента неоднородных эритроцитов рассматривается как ранний признак анемии, когда другие морфологические изменения в эритроцитах еще не наблюдаются.

Показатель также может быть полезен для контроля эффективности гемотерапии при железодефицитной или мегалобластной анемии. По мере образования новых, нормальных по размеру, эритроцитов RDW сначала повышается, но затем снижается, когда клетки нормальных размеров составляют большинство.

МСН отражает абсолютное содержание гемоглобина в эритроците. По клиническому значению этот показатель аналогичен цветовому показателю (ЦП), но МСН является более объективным параметром, отражающим абсолютное содержание гемоглобина в эритроците. ЦП – величина относительная и является отношением количества гемоглобина в одном эритроците пациента к нормальному его содержанию (принятому равным 33,3). Таким образом, чтобы перейти от значения MCH к ЦП (более привычному), достаточно разделить MCH на 33,3.

MCH является важным показателем в дифференциальной диагностике анемий в зависимости от которого анемии разделяют:

64

•Нормохромные (MCH=26–34 пг) – апластические анемии, анемии при лейкозах, миелодиспластическом синдроме (МДС), анемии при заболеваниях почек, эндокринных нарушениях, белковой недостаточности.

•Гипохромные (MCH <26 пг) – ЖДА, талассемии, сидеробластные анемии, анемии при злокачественных опухолях, хронических инфекциях, системных заболеваниях. Гипохромия может сочетаться как с уменьшением объема эритроцитов, так и наблюдаться при нормо- и макроцитозе.

•Гиперхромные (MCH >34 пг) – мегалобластные анемии (В12- и фолиеводефицитные), анемии при лейкозах (ХМЛ, острый эритромиелоз), тяжелые гемолитические анемии, лечение цитостатиками. Необходимо помнить, что снижение или повышение MCH не всегда

свидетельствует о гипоили гиперхромии эритроцитов. Например, при макроцитарных гипохромных анемиях MCH может быть в пределах нормы, а при микроцитарной анемии среднее содержание гемоглобина в эритроцитах будет снижено не за счет гипохромии, а вследствие уменьшения объема эритроцитов. В этом случае большое значение имеет правильная характеристика морфологии эритроцитов в мазках крови.

MCHC – средняя концентрация гемоглобина в эритроците. МСНС не зависит от клеточного объема, является чувствительным показателем нарушения процессов гемоглобинообразования. MCHC – стабильный, генетически детерминированный показатель (константная величина).

Насыщение более 380 г/л не бывает, т.к. это может закончиться кристаллизацией гемоглобина и гемолизом эритроцита. Этот показатель может быть использован как индикатор ошибки прибора или ошибки, допущенной при подготовке прибора к работе. Любая неточность, связанная с определением гемоглобина, гематокрита, среднего объема эритроцитов приводит к увеличению MCHC.

Повышение MCHC наблюдается крайне редко и встречается при наследственной микросфероцитарной гемолитической анемии.

Снижение MCHC ниже 320 г/л наблюдается при заболеваниях, связанных с нарушением синтеза гемоглобина: ЖДА, сидеробластные анемии, талассемия, полиэтиологические микроцитарно-гипохромные анемии, некоторые гемоглобинопатии, а также макроцитарные и особенно мегалоцитарные анемии, при которых наблюдается непропорционально большое увеличение объема эритроцита по сравнению с увеличением насыщения его гемоглобином;

синтез гемоглобина в эритрокариоците. Подобное состояние обусловлено патологиями, при которых происходит нарушение процессов производства железосодержащего белка. Необходимо подчеркнуть, что важным шагом при назначении препаратов железа является оценка не только указанных индексов, но и состоятельности гемоглобиновой цепочки у пациента по анализу количества трансферрина, рецепторов к трансферрину и ферритина.

65

Железо проникает в клетку вместе с трансферрином за счет рецепторопосредованного эндоцитоза (при участии рецепторов к трансферрину СD-71). В условиях низкого рН железо высвобождается и соединяется с протопорфирином, который синтезируется главным образом в митохондриях из глицина и сукцинил-КоА, образуя гем. Регулятором синтеза гема из железа является ферритин. Глобин синтезируется в клетке на рибосомах.

Молекула гема и одна из цепей глобина составляют субъединицу гемоглобина; четыре субъединицы образуют молекулу гемоглобина. Лишенный железа трансферрин (апотрансферрин) возвращается в плазму, а рецептор трансферрина – в клеточную мембрану. При нарушении синтеза гема вследствие дефицита железа или других причин развивается гипохромная анемия.

Гемоглобин. В анализаторе концентрацию гемоглобина оценивают с помощью встроенного спектрофотометра. Основными источниками ошибок в определении концентрации гемоглобина является повышенная мутность сыворотки при гиперлипидемии, гипербилирубинемии, криоглобулинемии, присутствии нестабильных гемоглобинов.

Так, например, при генетическом нарушении гемоглобиновой цепочки у пациентов с талассемией, железо, не соединенное с трансферрином, и свободный гемоглобин, циркулирующий в плазме, могут ускорять атерогенез. Механизм этого процесса сейчас интенсивно изучается, но уже выявлено, что свободные атомы железа индуцируют эндотелиальные активаторы и вызывают сосудистую адгезию молекул и эндотелиальных воспалительных хемокинов.

Современные тенденции анализа клеток периферической крови направлены на изучение гемодинамики в микроциркуляторном русле. Как ключевое звено микроциркуляции активно обсуждается фильтрационная способность эритроцитов, в основном определяющаяся свойствами клеточной мембраны и способностью эритроцита к деформации при прохождении по капилляру, имеющему диаметр меньший, чем сам эритроцит.

Активно обсуждаются факторы и механизмы, которые снижают способность эритроцитов к деформации, изменяют вязкостно-эластические свойства их мембраны и лишают клетки энергии. В свою очередь, даже при нормальном количестве эритроцитов и их параметров, возникают застойные явления в микроциркуляторном русле и как следствие – тканевая гипоксия с выраженными изменениями гомеостаза и гемодинамики.

Необходимо помнить, что одним из основных метаболических процессов, протекающих в эритроцитах, является гликолиз с целью получения аденозинтрифосфата (АТФ). Глюкоза – главный источник энергии для жизнедеятельности эритроцита. Прекращение гликолиза приводит эритроцит к «метаболической смерти» – гемолизу. Нарушение углеводного обмена и гликолиза в эритроците лишают клетку энергии, т.е. изменяют вязкостноэластические свойства ее мембраны и снижают способность эритроцитов к деформации.

66