- •От имени Всемирной организации здравоохранения
- •Акронимы и аббревиатуры, используемые в этом руководстве
- •Глава 1. Введение
- •1.1 Сфера охвата руководства
- •1.2 Введение
- •1.3 Шестое издание
- •Глава 2. Базовое исследование
- •2.1 Введение
- •2.2 План базового исследования эякулята с указанием сроков
- •2.3 Процедуры, предшествующие исследованию
- •2.4 Процедуры исследования и последующие процедуры
- •2.5 Дополнительная информация и комментарии
- •3.1 Индексы множественных дефектов сперматозоидов
- •3.2 Фрагментация ДНК сперматозоидов
- •3.3 Генетические и геномные исследования
- •3.4 Исследования, связанные с иммунологией и иммунологическими методами
- •3.5 Оценка интерлейкинов – маркера воспаления мужских половых путей
- •3.6 Оценка незрелых половых клеток в эякуляте
- •3.7 Исследования для обнаружения сперматозоидов, покрытых антителами
- •3.8 Биохимические анализы функции добавочных половых желез
- •3.9 Оценка последовательности эякуляции
- •Глава 4.Углубленные исследования
- •4.1 Исследования оксидативного стресса сперматозоидов и активных форм кислорода
- •4.2 Оценка акросомной реакции
- •4.3 Оценка хроматина сперматозоидов
- •4.4 Трансмембранный поток и перенос ионов в сперматозоидах
- •4.5 Компьютерный анализ эякулята (CASA)
- •4.6 Новые технологии
- •Глава 5. Методы подготовки сперматозоидов
- •5.1 Введение
- •5.2 Общие принципы
- •5.3 Простое отмывание
- •5.4 Прямое всплытие
- •5.5 Прерывистые градиенты плотности
- •5.6 Сортировка клеток с магнитной активацией (MACS)
- •5.7 Подготовка образцов ВИЧ-инфицированного эякулята
- •5.8 Подготовка сперматозоидов из ткани яичка и придатка яичка
- •5.9 Подготовка образцов при ретроградной эякуляции
- •5.10 Подготовка образцов, полученных в результате ассистированной эякуляции
- •Глава 6. Криоконсервация сперматозоидов
- •6.1 Введение
- •6.2 Причины криоконсервации сперматозоидов
- •6.3 Оценка риска криоконсервации и хранения эякулята человека
- •6.4 Протоколы криоконсервации эякулята
- •6.5 Витрификация
- •Глава 7. Обеспечение качества и контроль качества
- •7.1 Контроль качества в андрологической лаборатории
- •7.2 Характер ошибок при исследовании эякулята
- •7.3 Программа по ОК
- •7.4 Карты КК для числовых значений
- •7.5 Карты КК для процентных соотношений
- •7.6 Оценка Xbar- и S-карт
- •7.7 Статистические процедуры для анализа и отчетности по изменчивости результатов, полученных разными лаборантами
- •7.8 Внешний контроль качества и процедуры обеспечения качества
- •7.9 Частота и приоритетность процедур контроля качества
- •7.10 Обучение
- •Глава 8. Приложения
- •8.1 Интерпретация результатов исследования эякулята
- •8.2 Оборудование и безопасность
- •8.3 Микроскопия для базового исследования эякулята
- •8.4 Исходные растворы и среды
- •8.5 Образец формы для записи результатов исследования эякулята
- •8.6 Материал для КК
- •8.7 Национальные программы внешнего контроля качества исследований эякулята
- •Глава 9. Справочная литература
- •Таблица 2.1 Достаточные объемы эякулята – конечные объемы разведенных суспензий сперматозоидов для соответствующей обработки
- •Таблица 2.2 Приемлемые различия (на основе 95%-ного доверительного интервала) между двумя процентными значениями для конкретного среднего значения, определенного на основе двойного подсчета 200 сперматозоидов (всего 400 подсчитанных сперматозоидов)
- •Таблица 2.3 Сравнение различий между результатами подсчета и связь со степенью неопределенности результата
- •Таблица 2.4 Расчеты концентрации сперматозоидов на основе их подсчета
- •Таблица 2.5 Этапы фиксации и окрашивания по Папаниколау
- •Таблица 2.6 Морфологическая классификация сперматозоидов
- •Таблица 2.7 Мазок 1 с окрашиванием по Папаниколау
- •Таблица 2.8 Мазок 2 с окрашиванием по Папаниколау
- •Таблица 2.9 Мазок 3 с окрашиванием по Папаниколау
- •Таблица 2.10 Мазок 4 с окрашиванием по Папаниколау
- •Таблица 2.11 Мазок 5 с окрашиванием по Папаниколау
- •Таблица 2.12 Вероятность наличия необнаруженных сперматозоидов при исследовании влажных препаратов
- •Таблица 2.13 Вероятность наличия необнаруженных сперматозоидов после центрифугирования
- •Таблица 2.14 Мазок с окрашиванием по Шорру
- •Таблица 2.15 Мазок с окрашиванием DiffQuik
- •Таблица 3.1 Расчет индексов множественных дефектов сперматозоидов
- •Таблица 3.2 Индексы дефектов сперматозоидов для мужчин в фертильных и бесплодных парах
- •Таблица 3.3 Базальные уровни дисомии хромосом сперматозоидов у здоровых фертильных мужчин
- •Таблица 3.4 Объем эякулята, необходимый для проведения иммуногранулотеста
- •Таблица 3.5 Рекомендуемые стандартные растворы для оценки концентрации цинка
- •Таблица 3.6 Рекомендуемые стандартные растворы для оценки концентрации фруктозы
- •Таблица 3.7 Рекомендуемые стандартные растворы для оценки уровней активности α-гликозидазы
- •Таблица 7.1 Терминология обеспечения качества и контроля качества
- •Таблица 7.2 Расчеты значений для Xbar-карты
- •Таблица 7,3 Факторы, необходимые для расчета предупредительных границ и пределов для вмешательства для Xbar-карты
- •Таблица 7.4 Расчет предупредительных границ и пределов для вмешательства для S-карты
- •Таблица 7.5 Основные правила контроля для карт КК
- •Таблица 7.6 Концентрация сперматозоидов (x106/мл) в пяти образцах для КК, оцененная тремя сотрудниками
- •Таблица 7.7 Отличия значений образцов от среднего значения, рассчитанные путем вычитания среднего значения из значений, полученных для каждого образца эякулята
- •Таблица 7.8 Среднее значение, СО и среднее значение/стандартная ошибка этих различий, рассчитанные для каждого сотрудника (n = число образцов)
- •Таблица 7.9 Пошаговая инструкция по расчету меры отклонения
- •Таблица 7.10 F-тест двустороннего анализа ANOVA для лаборантов и образцов для КК
- •Таблица 7.11 Основные особенности процедур ВКК
- •Таблица 7.12 Временной график КК
- •Таблица 7.13 Обзор методов КК
- •Таблица 7.14 Источники отклонений (ошибок) при оценке концентрации сперматозоидов
- •Таблица 7.15 Источники отклонений (ошибок) при морфологической оценке сперматозоидов
- •Таблица 7.16 Источники отклонений (ошибок) при оценке подвижности сперматозоидов
- •Таблица 7.17 Источники отклонений (ошибок) при оценке жизнеспособности сперматозоидов
- •Таблица 8.1 Определение референтной группы в документе Кэмпбелла и др. (5)
- •Таблица 8.2 Происхождение данных для распределения результатов (5)
- •Таблица 8.4 Образец формы для записи результатов исследования эякулята
|
Введение .1 |
|
|
|
|
Базовое .2 исследование |
|
|
|
|
|
исследование |
Расширенное 3: |
|
|
|
|
исследования |
Углубленные.4 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
подготовки Методы .5 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
Криоконсервация .6 |
|
|
|
|
качества Обеспечение .7 качества контроль и |
|
|
|
|
|
|
Приложения .8 |
|
|
Справочная .9 литература |
Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание
•Каждый образец от конкретного донора обозначается номером, следующим за его личным кодом. Так, например, восьмой образец, собранный донором BT, обозначается BT-8.
•Буквенный код и номер образца должны быть написаны на каждой соломине или пробирке черным несмываемым маркером. В качестве альтернативы используйте напечатанные этикетки с указанием имени, фамилии и даты рождения пациента и даты криоконсервации. Такие этикетки должны быть предназначены для использования в жидком азоте. Должное внимание следует уделять тому, чтобы выбранные этикетки не могли быть повреждены со временем.
•Минибокалы (или альтернативные сосуды), в которых хранятся соломины, должны также иметь наклейки с четкой маркировкой, содержащей код и номер образца, и в них должны содержаться только образцы, полученные от данного пациента в данном случае.
•Для быстрой идентификации может быть также полезна цветовая маркировка более крупных бокалов, содержащих многочисленные образцы, и минибокалов.
•По мере использования хранящихся сперматозоидов количество соломин или пробирок корректируется в базе данных.
Примечание. Все процедуры, связанные с идентификацией образцов доноров или пациентов, включая получение образцов, подготовку и маркировку соломин, помещение в контейнеры и размораживание соломин для использования или удаления, должны быть дважды проверены более чем одним сотрудником, и сведения об этой проверке должны быть зафиксированы в лабораторных записях. В идеале в любой момент времени лаборант должен обрабатывать только один образец эякулята.
Все образцы должны иметь код, позволяющий идентифицировать их во время хранения и транспортировки из банка спермы в принимающий центр.
6.5 Витрификация
Появляются данные, свидетельствующие о том, что витрификация может быть ценным методом криоконсервации эякулированных сперматозоидов (404). Принцип метода заключается в сверхбыстром замораживании небольшого объема образца при непосредственном контакте с жидким азотом, не содержащим загрязнений, что должно предотвратить образование льда и уменьшить осмотическое повреждение. Возможна также витрификация в соломинах (асептическая витрификация), при которой используется закрытая система и не требуется стерильный жидкий азот. Витрификация может быть проведена для цельной спермы или отдельных сперматозоидов с использованием как проникающих, так и непроникающих разбавителей и может быть использована для криоконсервации одного или небольшого числа сперматозоидов (405). Вместе с тем на данный момент получено ограниченное количество данных об улучшении параметров сперматозоидов после их размораживания после витрификации по сравнению с традиционными методами (406), и поэтому витрификацию сперматозоидов следует рассматривать как экспериментальную процедуру.
208
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
|
Введение .1 |
|
|
|
|
Базовое .2 исследование |
|
|
|
|
|
исследование |
Расширенное 3: |
|
|
|
|
исследования |
Углубленные.4 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
подготовки Методы .5 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
Криоконсервация .6 |
|
|
|
|
качества Обеспечение .7 качества контроль и |
|
|
|
|
Приложения .8 |
Справочная .9 литература |
Глава 6. Криоконсервация сперматозоидов
6.5.1.1 Протокол прямой витрификации
При витрификации в сочетании с использованием так называемых «открытых» устройств требуется прямое воздействие жидкого азота на образец, а такое воздействие создает дополнительные риски контаминации. Рекомендуется всегда использовать стерильный жидкий азот. Кроме того, эта процедура может быть опасной для лаборанта, который всегда должен использовать соответствующие средства защиты.
Материалы
•криопротекторы;
•стерильный жидкий азот;
•бокс для жидкого азота;
•небольшое ситечко для сбора витрифицированных сфер;
•криопробирки.
Метод (из документа Исаченко и др. (404))
1.После разведения равным объемом разбавителя10 эякулят, капля за каплей, непосредственно погружают в свободный от загрязнений жидкий азот, используя одноразовый контейнер.
2.Затем полученные сферы помещают в криопробирки, которые незамедлительно погружают в жидкий азот и хранят в нем.
6.5.1.2 Протокол витрификации в соломинах
При витрификации в соломинах (асептическая витрификация) используется закрытая асептическая система в виде двойных (одна внутри другой) полностью запечатанных соломин без прямого контакта с жидким азотом, и этот метод позволяет витрифицировать больший объем образца (100 мл) с большим количеством сперматозоидов (404, 407, 408). Эта процедура менее опасна для лаборанта.
Материалы
•соломины объемом 0,5 мл и 0,25 мл;
•среда для витрификации;
•бокс для жидкого азота;
•конические пробирки объемом 10 мл;
•среда для подогревания.
Метод 1. Приготовьте 1 мл витрификационной среды:
• среда для отмывания сперматозоидов или HTF: |
0,495 мл; |
10 Тип разбавителя, температура криопротектора и время воздействия криопротектора на клетки имеют решающее значение и могут повлиять на эффективность процесса.
209
|
Введение .1 |
|
|
|
|
Базовое .2 исследование |
|
|
|
|
|
исследование |
Расширенное 3: |
|
|
|
|
исследования |
Углубленные.4 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
подготовки Методы .5 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
Криоконсервация .6 |
|
|
|
|
качества Обеспечение .7 качества контроль и |
|
|
|
|
|
|
Приложения .8 |
|
|
Справочная .9 литература |
Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание
•0,5 М сахарозы, растворенной в воде (например MP Biomedicals, Cat. 152584): 0,495 мл;
•Dextran Serum Supplement (e.g. IrvineScientific, Cat. 9301): 0,010 мл.
2.Используйте сперматозоиды (свободные от семенной плазмы), отобранные методом всплытия или путем центрифугирования в градиенте плотности в соответствии с параметрами сперматозоидов и протоколами местной лаборатории.
3.После извлечения отобранных сперматозоидов произведите подсчет сперматозоидов, сконцентрируйте их центрифугированием (8–10 минут при 300g), полностью удалите супернатант и добавьте соответствующее количество витрификационной среды для ресуспендирования осадка (рассчитывается следующим образом):
•объем суспензии для витрификации на соломину (объемом 0,25 мл): 100 мкл
•концентрация эякулята на соломину: 0,1–3,0 x106 сперматозоидов
Пример:
Всего извлечено 15 x106 сперматозоидов
Целевое количество для консервации: 3 x106 сперматозоидов/100 мкл (объем на соломину)
1 мл = 30 x106 сперматозоидов
X vol = 15 x106 извлеченных сперматозоидов
Следовательно,X=0,5млвитрификационнойсреды(0,5млвитрификационной среды позволит получить 5 x 100 мкл соломин, каждая из которых содержит
3 x106 сперматозоидов).
4.Смешайте осадок сперматозоидов с витрификационной средой непосредственно перед витрификацией (при комнатной температуре). Не рекомендуется подвергать клетки воздействию витрификационной среды в течение длительного времени.
5.Соломина объемом 0,25 мл должна быть обрезана на две трети своей первоначальной длины. Затем она располагается горизонтально, и в открытый конец с помощью пипетки набирается аликвота объемом 100 мкл. На всех последующих стадиях необходимо сохранять горизонтальное положение соломины, чтобы не потерять аликвоту.
6.Затем эта соломина вставляется в соломину объемом 0,5 мл, которая термозапечатывается с обоих концов. Соломину следует незамедлительно погрузить в жидкий азот на 5 секунд в горизонтальном положении с помощью пинцета и затем хранить в жидком азоте.
Процедура подогревания после витрификации
1.Приготовьте среду для подогревания.
2.Разморозьте содержимое соломин/криопробирок в среде, предварительно подогретой до 42–43°C.
210
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/