- •От имени Всемирной организации здравоохранения
- •Акронимы и аббревиатуры, используемые в этом руководстве
- •Глава 1. Введение
- •1.1 Сфера охвата руководства
- •1.2 Введение
- •1.3 Шестое издание
- •Глава 2. Базовое исследование
- •2.1 Введение
- •2.2 План базового исследования эякулята с указанием сроков
- •2.3 Процедуры, предшествующие исследованию
- •2.4 Процедуры исследования и последующие процедуры
- •2.5 Дополнительная информация и комментарии
- •3.1 Индексы множественных дефектов сперматозоидов
- •3.2 Фрагментация ДНК сперматозоидов
- •3.3 Генетические и геномные исследования
- •3.4 Исследования, связанные с иммунологией и иммунологическими методами
- •3.5 Оценка интерлейкинов – маркера воспаления мужских половых путей
- •3.6 Оценка незрелых половых клеток в эякуляте
- •3.7 Исследования для обнаружения сперматозоидов, покрытых антителами
- •3.8 Биохимические анализы функции добавочных половых желез
- •3.9 Оценка последовательности эякуляции
- •Глава 4.Углубленные исследования
- •4.1 Исследования оксидативного стресса сперматозоидов и активных форм кислорода
- •4.2 Оценка акросомной реакции
- •4.3 Оценка хроматина сперматозоидов
- •4.4 Трансмембранный поток и перенос ионов в сперматозоидах
- •4.5 Компьютерный анализ эякулята (CASA)
- •4.6 Новые технологии
- •Глава 5. Методы подготовки сперматозоидов
- •5.1 Введение
- •5.2 Общие принципы
- •5.3 Простое отмывание
- •5.4 Прямое всплытие
- •5.5 Прерывистые градиенты плотности
- •5.6 Сортировка клеток с магнитной активацией (MACS)
- •5.7 Подготовка образцов ВИЧ-инфицированного эякулята
- •5.8 Подготовка сперматозоидов из ткани яичка и придатка яичка
- •5.9 Подготовка образцов при ретроградной эякуляции
- •5.10 Подготовка образцов, полученных в результате ассистированной эякуляции
- •Глава 6. Криоконсервация сперматозоидов
- •6.1 Введение
- •6.2 Причины криоконсервации сперматозоидов
- •6.3 Оценка риска криоконсервации и хранения эякулята человека
- •6.4 Протоколы криоконсервации эякулята
- •6.5 Витрификация
- •Глава 7. Обеспечение качества и контроль качества
- •7.1 Контроль качества в андрологической лаборатории
- •7.2 Характер ошибок при исследовании эякулята
- •7.3 Программа по ОК
- •7.4 Карты КК для числовых значений
- •7.5 Карты КК для процентных соотношений
- •7.6 Оценка Xbar- и S-карт
- •7.7 Статистические процедуры для анализа и отчетности по изменчивости результатов, полученных разными лаборантами
- •7.8 Внешний контроль качества и процедуры обеспечения качества
- •7.9 Частота и приоритетность процедур контроля качества
- •7.10 Обучение
- •Глава 8. Приложения
- •8.1 Интерпретация результатов исследования эякулята
- •8.2 Оборудование и безопасность
- •8.3 Микроскопия для базового исследования эякулята
- •8.4 Исходные растворы и среды
- •8.5 Образец формы для записи результатов исследования эякулята
- •8.6 Материал для КК
- •8.7 Национальные программы внешнего контроля качества исследований эякулята
- •Глава 9. Справочная литература
- •Таблица 2.1 Достаточные объемы эякулята – конечные объемы разведенных суспензий сперматозоидов для соответствующей обработки
- •Таблица 2.2 Приемлемые различия (на основе 95%-ного доверительного интервала) между двумя процентными значениями для конкретного среднего значения, определенного на основе двойного подсчета 200 сперматозоидов (всего 400 подсчитанных сперматозоидов)
- •Таблица 2.3 Сравнение различий между результатами подсчета и связь со степенью неопределенности результата
- •Таблица 2.4 Расчеты концентрации сперматозоидов на основе их подсчета
- •Таблица 2.5 Этапы фиксации и окрашивания по Папаниколау
- •Таблица 2.6 Морфологическая классификация сперматозоидов
- •Таблица 2.7 Мазок 1 с окрашиванием по Папаниколау
- •Таблица 2.8 Мазок 2 с окрашиванием по Папаниколау
- •Таблица 2.9 Мазок 3 с окрашиванием по Папаниколау
- •Таблица 2.10 Мазок 4 с окрашиванием по Папаниколау
- •Таблица 2.11 Мазок 5 с окрашиванием по Папаниколау
- •Таблица 2.12 Вероятность наличия необнаруженных сперматозоидов при исследовании влажных препаратов
- •Таблица 2.13 Вероятность наличия необнаруженных сперматозоидов после центрифугирования
- •Таблица 2.14 Мазок с окрашиванием по Шорру
- •Таблица 2.15 Мазок с окрашиванием DiffQuik
- •Таблица 3.1 Расчет индексов множественных дефектов сперматозоидов
- •Таблица 3.2 Индексы дефектов сперматозоидов для мужчин в фертильных и бесплодных парах
- •Таблица 3.3 Базальные уровни дисомии хромосом сперматозоидов у здоровых фертильных мужчин
- •Таблица 3.4 Объем эякулята, необходимый для проведения иммуногранулотеста
- •Таблица 3.5 Рекомендуемые стандартные растворы для оценки концентрации цинка
- •Таблица 3.6 Рекомендуемые стандартные растворы для оценки концентрации фруктозы
- •Таблица 3.7 Рекомендуемые стандартные растворы для оценки уровней активности α-гликозидазы
- •Таблица 7.1 Терминология обеспечения качества и контроля качества
- •Таблица 7.2 Расчеты значений для Xbar-карты
- •Таблица 7,3 Факторы, необходимые для расчета предупредительных границ и пределов для вмешательства для Xbar-карты
- •Таблица 7.4 Расчет предупредительных границ и пределов для вмешательства для S-карты
- •Таблица 7.5 Основные правила контроля для карт КК
- •Таблица 7.6 Концентрация сперматозоидов (x106/мл) в пяти образцах для КК, оцененная тремя сотрудниками
- •Таблица 7.7 Отличия значений образцов от среднего значения, рассчитанные путем вычитания среднего значения из значений, полученных для каждого образца эякулята
- •Таблица 7.8 Среднее значение, СО и среднее значение/стандартная ошибка этих различий, рассчитанные для каждого сотрудника (n = число образцов)
- •Таблица 7.9 Пошаговая инструкция по расчету меры отклонения
- •Таблица 7.10 F-тест двустороннего анализа ANOVA для лаборантов и образцов для КК
- •Таблица 7.11 Основные особенности процедур ВКК
- •Таблица 7.12 Временной график КК
- •Таблица 7.13 Обзор методов КК
- •Таблица 7.14 Источники отклонений (ошибок) при оценке концентрации сперматозоидов
- •Таблица 7.15 Источники отклонений (ошибок) при морфологической оценке сперматозоидов
- •Таблица 7.16 Источники отклонений (ошибок) при оценке подвижности сперматозоидов
- •Таблица 7.17 Источники отклонений (ошибок) при оценке жизнеспособности сперматозоидов
- •Таблица 8.1 Определение референтной группы в документе Кэмпбелла и др. (5)
- •Таблица 8.2 Происхождение данных для распределения результатов (5)
- •Таблица 8.4 Образец формы для записи результатов исследования эякулята
|
Введение .1 |
|
|
|
|
Базовое .2 исследование |
|
|
|
|
|
исследование |
Расширенное 3: |
|
|
|
|
исследования |
Углубленные.4 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
подготовки Методы .5 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
Криоконсервация .6 |
|
|
|
|
качества Обеспечение .7 качества контроль и |
|
|
|
|
Приложения .8 |
Справочная .9 литература |
Глава 3. Расширенное исследование
3.8.4 Пулы семенной плазмы для внутреннего контроля качества
Одним из необходимых компонентов биохимической оценки эякулята является систематическое использование образцов для ВКК, который должен проводиться применительно к каждой серии. Свободную от сперматозоидов семенную плазму, полученную после центрифугирования (при 3000g в течение 10–15 минут), следует хранить до проведения оценки при температуре –20°C. Оставшуюся после анализа семенную плазму можно повторно замораживать и один или два раза в год использовать для приготовления большого пула смешанной семенной плазмы, которая после тщательного перемешивания (магнитной мешалкой при комнатной температуре) аликвотируется в объемах, достаточных для проведения серии биохимических анализов. Образцы для КК могут храниться в герметичных пробирках при температуре –20°C до 12 месяцев.
Новая серия пула семенной плазмы используется параллельно с текущими образцами для КК в нескольких препаратах в рамках проведения по меньшей мере трех различных анализов для каждого аналита. Таким образом оценивается вариабельность результатов в пределах одного и разных анализов и определяется общая приемлемая вариабельность новой серии семенной плазмы для КК.
3.9 Оценка последовательности эякуляции
Нормальная последовательность эякуляции имеет физиологическое значение для функции сперматозоидов и их нормальной способности к оплодотворению и эмбриональному развитию. Нормальная последовательность означает, что подавляющее большинство сперматозоидов извергается в первых фракциях эякулята преимущественно вместе с секретом предстательной железы, тогда как в последующих двух третях эякулята преобладает жидкость семенных пузырьков (251, 252). Хорошо известно, что при первичном контакте с богатым цинком секретом предстательной железы подвижность, выживаемость и стабильность хроматина сперматозоидов повышаются, в то время как при первичном контакте со щелочной, связывающей цинк жидкостью семенных пузырьков наблюдается обратная картина (13, 253–257).
Воспалительные процессы в предстательной железе или врожденные пороки развития могут вызвать стеноз (или обструкцию семявыбрасывающего протока – ОСП) в отверстиях семявыбрасывающих протоков, открывающихся в уретру, или рядом с ними (258–265). Последствием стеноза будет задержка поступления сперматозоидов в уретру до тех пор, пока под давлением сокращающихся семенных пузырьков содержимое семявыбрасывающего протока не попадет в уретру. Лабораторным результатом при обычном исследовании эякулята будет, прежде всего, плохая подвижность.
Даже биохимическая оценка всего эякулята не покажет, подвергались ли сперматозоиды аномальному воздействию жидкости семенных пузырьков. Единственным способом диагностировать ОСП путем исследования эякулята является сбор отдельных фракций эякулята и исследование содержания, подвижности и биохимического состава сперматозоидов (секрета предстательной железы и семенных пузырьков соответственно) (13).
Если диагностирована нарушенная последовательность эякуляции, существуют малоинвазивные хирургические методы лечения ОСП (266–272); кроме того, негативное влияние жидкости семенных пузырьков можно
153
|
Введение .1 |
|
|
|
|
Базовое .2 исследование |
|
|
|
|
|
исследование |
Расширенное 3: |
|
|
|
|
исследования |
Углубленные.4 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
подготовки Методы .5 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
Криоконсервация .6 |
|
|
|
|
качества Обеспечение .7 качества контроль и |
|
|
|
|
|
|
Приложения .8 |
|
|
Справочная .9 литература |
Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание
уменьшить, предоставив мужчине возможность собрать весь эякулят непосредственно в среду для отмывки сперматозоидов.
3.9.1 Оборудование – в дополнение к обычному исследованию эякулята
Сюда входит любой набор устройств для сбора эякулята, позволяющий пациенту собрать фракции эякулята в том порядке, в котором они извергаются.
Рис. 3.8 Два примера устройств для сбора разделенного эякулята
A
B
Воспроизведено с разрешения A Practical Guide to Practical Laboratory Andrology, Cambridge University Press (273)
3.9.2 Процедуры для пациента
Пациента инструктируют собрать фракции эякулята в том порядке, в котором они будут извергаться, причем этот порядок подтверждается пациентом при предоставлении пробирок в лабораторию. Пробирки должны быть пронумерованы в последовательном порядке в дополнение к их обычной идентификационной маркировке.
3.9.3 Процедуры обработки образцов
Образование преципитата или геля возможно только во фракциях с преобладанием секрета семенных пузырьков. Исследование фракций, в которых преобладает секрет предстательной железы, можно начинать через
154
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/
|
Введение .1 |
|
|
|
|
Базовое .2 исследование |
|
|
|
|
|
исследование |
Расширенное 3: |
|
|
|
|
исследования |
Углубленные.4 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
подготовки Методы .5 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
Криоконсервация .6 |
|
|
|
|
качества Обеспечение .7 качества контроль и |
|
|
|
|
Приложения .8 |
Справочная .9 литература |
|
|
|
|
|
Глава 3. Расширенное исследование |
||
|
|
|
5–10 минут после доведения температуры до 37°C (для оценки подвижности). |
||||
|
|
|
Фракции с преципитатом могут быть растворены в течение 30 минут при 37°C. |
||||
|
|
|
Фракции, не содержащие протеаз простатического происхождения, могут не |
||||
|
|
|
разжижаться более длительное время. |
|
|
|
|
|
|
|
3.9.4 Исследование |
|
|
|
|
|
|
|
Оценка объема, числа сперматозоидов, подвижности, а также уровней цинка |
||||
|
|
|
(маркер предстательной железы) и фруктозы (маркер семенных пузырьков) |
||||
|
|
|
проводится в соответствии с обычным исследованием цельного эякулята. |
||||
|
|
|
3.9.5 Расчет |
|
|
|
|
|
|
|
Рассчитайте относительное распределение объема, числа сперматозоидов, |
||||
|
|
|
доли прогрессивно подвижных сперматозоидов и биохимических маркеров. |
||||
|
|
|
Сначала подсчитайте общее число в каждой фракции, затем относительное |
||||
|
|
|
распределение в каждой фракции (рис. 3.9). |
|
|
||
Рис. 3.9 Пример графического представления результатов исследования нормального четырехфракционного |
|||||||
разделенного эякулята, демонстрирующий распределение таких показателей, как объем, число сперматозоидов, |
|||||||
прогрессивная подвижность и уровни цинка и фруктозы |
|
|
|
|
|||
|
100 |
|
|
|
|
1,80 |
|
|
90 |
|
|
|
|
1,60 |
Молярное соотношение цинка/фруктозы |
Относительное распределение (в %) |
80 |
|
|
|
|
1,40 |
|
|
|
|
|
|
|||
70 |
|
|
|
|
1,20 |
||
|
|
|
|
|
|||
60 |
|
|
|
|
1,00 |
||
50 |
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
0,80 |
|||
40 |
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
|||
30 |
|
|
|
|
0,60 |
||
|
|
|
|
|
|||
20 |
|
|
|
|
0,40 |
||
|
|
|
|
|
|||
10 |
|
|
|
|
0,20 |
||
|
|
|
|
|
|
||
|
0 |
Фракция 1 |
Фракция 2 |
Фракция 3 |
Фракция 4 |
0,00 |
|
|
|
|
|
||||
|
Объем |
Число |
Прогрессивно |
Цинк |
Фруктоза |
Молярное |
|
|
|
сперматозоидов |
подвижные |
|
|
соотношение |
|
|
|
|
|
|
|
цинка/фруктозы |
Воспроизведено с разрешения A Practical Guide to Practical Laboratory Andrology, Cambridge University Press (273)
155
|
Введение .1 |
|
|
|
|
Базовое .2 исследование |
|
|
|
|
|
исследование |
Расширенное 3: |
|
|
|
|
исследования |
Углубленные.4 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
подготовки Методы .5 |
|
|
|
|
сперматозоидов |
Криоконсервация .6 |
|
|
|
|
качества Обеспечение .7 качества контроль и |
|
|
|
|
|
|
Приложения .8 |
|
|
Справочная .9 литература |
Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание
3.9.6 Интерпретация
Основная масса сперматозоидов, как ожидается, находится в первой трети эякулята, где преобладает богатый цинком секрет предстательной железы. Поступление значительного количества жидкости семенных пузырьков в богатую сперматозоидами фракцию (фракции) указывает на нефизиологическую ситуацию, которая может подавлять функциональную способность сперматозоидов.
Выявление фракции эякулята с хорошей прогрессивной подвижностью может быть полезным для будущего отбора сперматозоидов для ВРТ, что было описано задолго до наступления эпохи ЭКО (274).
Кроме того, для лабораторий, не имеющих возможности определять такие маркеры функции добавочных желез, как концентрация цинка и фруктозы, полезная информация может быть получена путем оценки относительного распределения сперматозоидов и прогрессивной подвижности, с тем чтобы определить возможные источники сперматозоидов с более высокой вероятностью успешного оплодотворения.
156
Рекомендовано к покупке и изучению сайтом МедУнивер - https://meduniver.com/