- •(Экспериментальное исследование)
- •Список сокращений и аббревиатур, использованных в работе
- •Глава 1. Перспективы применения ксеногенной ткани селезенки для коррекции постспленэктомических нарушений (обзор литературы) 10
- •Глава 2. Материалы и методы исследования 25
- •Глава 3. Получение криоконсервированных клеток селезенки свиньи для ксенотрансплантации 41
- •Глава 4. Морфофункциональная оценка эффективности ксенотрансплантации клеток селезенки как способа коррекции индуцированного гипоспленизма 55
- •Глава 5. Изменения гомеостаза в условиях постсплен-эктомического гипоспленизма, корригированного ксенотрансплантацией клеток селезенки 79
- •Введение
- •Глава 1. Перспективы применения ксеногенной ткани селезенки для коррекции постспленэктомических нарушений (обзор литературы)
- •Проблема постспленэктомического гипоспленизма
- •1.1.1. Клинико-лабораторные проявления синдрома постспленэктомического гипоспленизма
- •1.1.2. Способы профилактики и коррекции гипоспленических послеоперационных расстройств
- •Ксенотрансплантация свиных органов и тканей
- •1.3. Технология получения материала для ксенотрансплантации
- •Глава 2. Материалы и методы исследования
- •2.1 Общая характеристика экспериментального материала
- •2.2. Характеристика методов исследования
- •2.2.1. Техника оперативных вмешательств
- •2.2.1.1. Ложная операция
- •2.2.1.2. Спленэктомия
- •2.2.1.3. Экстраперитонеальная аутотрансплантация селезенки
- •2.2.1.4. Ксенотрансплантация клеток селезенки
- •2.2.2.Приготовление препаратов для ксенотрансплантации
- •2.2.2.1. Получение взвеси клеток селезенки
- •2.2.2.2. Приготовление питательной среды для инъекции
- •2.2.2.3 Ранотензиометрия
- •2.2.3. Методы лабораторного контроля
- •2.2.3.1.Определение биохимических показателей сыворотки крови
- •2.2.3.3. Исследование показателей системы гемостаза
- •2.2.3.4 Иммунологические методы исследований
- •2.2.3.5 Общеклиническое исследование крови
- •2.2.3.6 Бактериологические методы исследований
- •2.2.4. Методы морфологического исследования
- •2.3.Методы статистической обработки
- •Глава 3. Получение криоконсервированных клеток селезенки свиньи для ксенотрансплантации
- •3.1.Технология выделения клеток селезенки
- •3.1.1 Дезагрегация ткани селезенки
- •3.1.2. Оптимизация рН среды для культивации клеток
- •3.1.3 Культивирование клеток селезенки новорожденной свиньи
- •3.2.Консервация клеток
- •3.2.1. Приготовление среды для криоконсервации
- •3.3. Получение препарата и ксенотрансплантация
- •Глава 4. Морфофункциональная оценка эффективности ксенотрансплантации клеток селезенки как способа коррекции индуцированного гипоспленизма
- •4.1 Развитие постспленэктомического гипоспленизма в ходе эксперимента
- •4.2 Летальность в экспериментальных группах
- •4.2.1. Патоморфологическое исследование погибших животных
- •4.3. Морфологическая оценка эффектов трансплантации ткани селезенки в условиях гипоспленизма
- •4.3.1 Исследование структуры печени
- •4.3.2.Исследование структуры легких
- •4.4. Морфологическое исследование зон трансплантации
- •4.5. Результаты ранотензиометрических исследований
- •Глава 5. Изменения гомеостаза в условиях постсплен-эктомического гипоспленизма, корригированного ксенотрансплантацией клеток селезенки
- •5.1. Лабораторная оценка раннего гепатопротекторного эффекта ксенотрансплантации культуры клеток селезенки
- •5.2. Влияние ксенотрансплантации клеток селезенки на белково-синтетическую функцию печени в раннем послеоперационном периоде
- •5.3. Изменения неспецифической резистентности организма у аспленизизированных животных под воздействием ксенотрансплантации клеток селезенки в раннем послеоперационном периоде
- •5.4. Влияние ксенотрансплантации клеток селезенки на систему гемостаза в раннем периоде после индукции гипоспленизма
- •Заключение
- •Практические рекомендации
- •Список использованной литературы
4.2.1. Патоморфологическое исследование погибших животных
При морфологическом исследовании печени погибших на 5-6 сутки крыс групп ОГ-2, КГ-2, 6 сутки в КГ-1 отмечали повреждения гепатоцитов с очагами некрозов (более 1/3 площади среза) и лейкоцитарной инфильтрацией, участки дискомплексации балочных структур. Наиболее выраженные изменения были обнаружены на светооптическом уровне в зоне портальных трактов (рис.4.2).
Рис.4.2. Изменение структуры печени погибшей на 5 сутки аспленизированной крысы. 1- очаги некроза гепатоцитов и лейкоцитарная инфильтрация. Окраска гематоксилином и эозином. Об. 40х , Ок. 10х.
У всех крыс, погибших на 7 сутки (ОГ-2, КГ-1, КГ-2), при исследовании структуры печени отмечены изменения, аналогичные наблюдаемым у погибших на 5 сутки. Морфологические изменения в печени крыс, погибших на 8 сутки в ОГ-2, КГ-1, КГ-2 и на 9 сутки в КГ-2, были представлены мелкоочаговыми некрозами, поврежденными гепатоцитами (до 1/3 площади среза), около некротически измененных гепатоцитов наблюдались скопления нейтрофилов. У погибших крыс в ОГ-1 на 8-9-е сутки в печени отмечали повреждение структуры гепатоцитов с очагами некроза и лейкоцитарной инфильтрацией до 1/3 площади среза. На 10-е сутки у погибших крыс в ОГ-1 и КГ-1 отмечали изменения в печени, аналогичные изменениям у погибших ранее в этой группе. Морфологические изменения в печени крыс погибших на 13-15 сутки в КГ-2 были представлены мелкоочаговыми некрозами, поврежденными гепатоцитами (до 1/3 площади среза) и лейкоцитарной инфильтрацией в зоне портальных трактов. Таким образом, складывалось впечатление, что у животных, погибших в более поздние сроки после операции, изменения в печени были менее выраженными по сравнению с погибшими на 5-7 сутки.
Признаков перитонита или внутрибрюшинного кровотечения не выявлено ни в одном наблюдении.
Морфологические изменения в легких крыс, погибших на 5-е сутки после аспленизации, проявлялись слабовыраженной межуточной пневмонией. Наблюдали утолщение межальвеолярных перегородок с инфильтрацией паренхимы лимфоцитами, макрофагами, сегментоядерными лейкоцитами, что отнесено нами к воспалительным изменениям первой степени (1 балл) - рис. 4.3А. У всех животных, погибших на 7 сутки (ОГ-2, КГ-1, КГ-2), признаки межуточной пневмонии были более выраженными, чем на 5 сутки. Отмечено появление некротических очагов с лейкоцитарной инфильтрацией по периферии (2 балла) - рис. 4.3Б. При заборе материала у крыс, погибших на 8-9 сутки после операции, при аутопсии в ткани легкого отмечали наличие абсцессов (рис. 4.3В). При световой микроскопии обнаруживали выраженную межуточную пневмонию с массивными очагами некрозов и участками абсцедирования (3 балла) - рис. 4.3Г.
Рис.4.3 Воспалительные изменения в легких крыс, погибших после аспленизации. А – смерть на 5-е сутки. Межуточная пневмония - 1 балл. 1- участки расширения межальвеолярных перегородок. Б – смерть на 7-е сутки после аспленизации. Межуточная пневмония - 2 балла. 1 - участки расширения межальвеолярных перегородок. 2- просвет бронха. В – макроскопическая картина (смерть на 9-е сутки). 3 - абсцесс легкого. Г – смерть на 8-е сутки. Абсцесс в легком. Межуточная пневмония - 3 балла. Эмфизема. 3 -абсцесс легкого, 4 - расширенные альвеолы, 5 - измененная легочная паренхима. А,Б, Г - окраска гематоксилином и эозином. Об. 4х , Ок. 10х.
Представленные данные свидетельствуют об увеличении воспалительных повреждений легочной ткани у крыс, погибших в более поздние сроки (8-9-е сутки послеоперационного периода), по сравнению с умершими на 5-6 сутки. Выше мы сообщили, что в отношении воспалительных изменений печени наблюдалась обратная закономерность.
Лишь в одном случае у погибшей на 5-е сутки крысы КГ-1 структура гепатоцитов была сохранена, структура балок и печеночных долек не нарушена, а в легких наблюдали массивные очаги межуточной пневмонии с участками некроза и абсцедированием (3 балла). Во всех остальных наблюдениях проявлялась указанная динамика воспалительных изменений в печени и легких.
Результаты статистической обработки обсуждаемых морфологических данных представлены в табл. 4.2.
Таблица 4.2
Балльная морфологическая оценка воспалительных изменений в печени и легких погибших крыс (средние значения)
Орган |
Сутки |
ОГ-1 |
ОГ-2 |
КГ-1 |
КГ-2 |
Печень |
5-6 сут |
- |
2,0 n=2 |
1,6 n=5 |
2,0 n=6 |
7-8 сут |
1,0 * n=2 |
1,8 n=11 |
1,2 * n=5 |
1,7 ¨ n=10 |
|
9-15 сут |
1,0 n=5 |
- |
1,0 n=2 |
1,0 · n=14 ·· |
|
Легкое |
5-6 сут |
- |
1,0 n=2 |
1,4 n=5 |
1,0 n=6 |
7-8 сут |
2,0 n=2 |
2,2 n=11 |
2,8 * n=5 |
2,3 · n=10 |
|
9-15 сут |
2,6 n=5 |
- |
3,0 n=2 |
3,0 ¨ · n=14 ·· |
Примечание: * - значимые различия по сравнению с ОГ-2 (рU<0,05); ¨- значимые различия по сравнению с ОГ-1 (рU<0,05); · - значимые различия при сравнении с показателем в той же группе на 5-6 сутки (рW <0,05); ·· - значимые различия при сравнении с показателем в той же группе на 7-8 сутки (рW <0,05).
При сравнительном анализе установлено, что у крыс, погибших на 7-8 сутки в ОГ-1, выраженность воспалительных изменений в печени была существенно ниже, чем в ОГ-2 и КГ-2 (1,0 балла против 1,8 и 1,7 балла; pU=0,03 и 0,01 соответственно). Следует отметить, что в ОГ-2 патологические изменения в те же сроки были более выраженными по сравнению с КГ-1 (1,8 балла против 1,2 балла; pU=0,02).
При внутригрупповом сравнении результатов патоморфологического исследования ткани печени животных, погибших на 5-6, 7-8 и 9-15 сутки эксперимента, статистически значимые различия определены лишь в КГ-2: при аутопсии на 9-15 сутки изменения в печени были существенно менее выраженными по сравнению с погибшими на 5-6 и 7-8 сутки (1,0 балла против 2,0 и 1,7 балла; pW=0,03 и 0,02 соответственно). При бактериологическом исследовании ткани легкого и смыва с плевральной полости у погибших крыс находили ассоциацию Streptococcus pneumoniae и Staphylococcus aureus.
При сравнительном анализе степени легочных повреждений статистически значимые различия определены у крыс, погибших в ОГ-2 и КГ-1 на 7-8 сутки эксперимента (2,2 балла против 2,8 балла; pU=0,02), а также у погибших на 9-15 сутки в ОГ-1 и КГ-2 (2,6 балла против 3,0 баллов; pU=0,01). У животных КГ-2 воспалительные изменения в легких при гибели на 9-15 сутки были существенно более выражены, чем у умерших на 5-6 и 7-8 сутки (3,0 балла против 1,0 балла и 2,3 балла; pW=0,03 и 0,02 соответственно). Также отмечены внутригрупповые различия у погибших на 5-6 и 7-8 сутки (1,0 балла против 2,3 балла; pW=0,03).
Представленные данные свидетельствуют о смене приоритетности поражений исследованных внутренних органов у погибших аспленизированных крыс. Таким образом, у животных, погибших на 5-6 сутки, доминировало поражение печени, в то время как в более поздние сроки преобладали воспалительные повреждения легочной паренхимы.
Проведенный непараметрический корреляционный анализ выявил статистически высокозначимую отрицательную корреляцию степени повреждений паренхимы печени со сроками гибели животных (rS=-0,66; p<<0,0001) и тесную положительную корреляцию воспалительных изменений в легких со сроками гибели (rS= 0,77; p<0,0001).
Полученные результаты побудили нас исследовать морфологию печени и легких у выживших животных. Рассмотрим результаты этого фрагмента исследования.