- •Гистологическая техника, цитология и общая эмбриология. У чебно-методическое пособие по самостоятельной внеаудиторной и аудиторной работе студентов лечебного и педиатрического факультетов.
- •Содержание
- •Тема 18
- •Тема 27
- •Предисловие
- •Тема этапы приготовления гистологического препарата. Методы и техника микроскопии.
- •Методические рекомендации по внеаудиторной самостоятельной работе студентов необходимый исходный уровень знаний
- •Литература для самоподготовки
- •Задания
- •Cитуационные задачи
- •Контрольные воросы
- •Методические рекомендации по самостоятельной аудиторной работе студентов
- •Взятие материала
- •II. Фиксация – метод обработки живого объекта фиксирующими веществами с целью сохранения прижизненной структуры органа или ткани.
- •III. Промывка в воде – для водорастворимых фиксаторов и в спирте – для спирторастворимых фиксаторов.
- •VI. Резка
- •VII. Депарафинизация.
- •VIII. Окрашивание
- •X. Заключение в бальзам.
- •I. Устройство микроскопа.
- •II. Техника микрокопирования.
- •I.Цито- и гистохимические методы исследования
- •II. Электронная микроскопия
- •II a. Подготовка материала для электронно-микроскопического исследования
- •Самостоятельная контрольная работа № 1
- •Самостоятельная контрольная работа № 2
- •На рисунке представлен оптический микроскоп. Цифрами отмечены детали.
- •Самостоятельная контрольная работа № 3
- •Тема клетка и неклеточные структуры
- •Методические рекомендации по внеаудиторной самостоятельной работе студентов необходимый исходный уровень знаний
- •Литература для самоподготовки
- •Задания
- •Cитуационные задачи
- •Контрольные воросы
- •Методические рекомендации по самостоятельной аудиторной работе студентов
- •Самостоятельная контрольная работа № 1
- •Самостоятельная контрольная работа № 2
- •Самостоятельная контрольная работа № 3
- •Тема ядро клетки. Деление клетки.
- •Методические рекомендации по внеаудиторной самостоятельной работе студентов необходимый уровень знаний
- •Литература для самоподготовки
- •Задания
- •Cитуационные задачи
- •Контрольные вопросы
- •Методические рекомендации по самостоятельной аудиторной работе студентов
- •Самостоятельная контрольная работа №2.
- •Самостоятельная контрольная работа № 3
- •Тема. Общая и сравнительная эмбриология.
- •Методические рекомендации по внеаудиторной самостоятельной работе студентов
- •Литература для самоподготовки
- •Задания
- •Cитуационные задачи
- •Контрольные вопросы
- •Методические рекомендации по самостоятельной аудиторной работе студентов
- •Самостоятельная контрольная работа. Вариант № 1
- •Самостоятельная контрольная работа. Вариант № 2
- •Самостоятельная контрольная работа. Вариант № 3
II a. Подготовка материала для электронно-микроскопического исследования
Подготовка к электронно-микроскопическому исследованию включает в себя те же этапы, что и при светооптической микроскопии, но с рядом особенностей.
Взятие материала необходимо проводить как можно быстрее, небольшими объемами (не более 1 мм3).
Фиксацию осуществляют, как правило, глутаральдегидом, хорошо стабилизирующим белки, с последующей дофиксацией в тетраоксиде осмия, который стабилизирует фосфолипиды, на холоде в течение нескольких часов. После фиксации материал промывают буферным раствором, обезвоживают спиртами возрастающей концентрации.
Уплотнение и заливку производят с помощью полимеризующейся смеси (эпоксидные смеси). Для этого образцы материала кладут в формы, заливают эпоксидной смолой и помещают в термостат, где происходит полимеризация смолы.
Для приготовления срезов (толщиной 30—50 нм) используют ультратомы, в которых подача блока с объектом на неподвижный нож осуществляется с помощью теплового расширения несущего стержня. В качестве ножей применяют специально приготовленные сколы стекла или алмазов. Получаемые при этом последовательные серийные срезы сползают с ножа в виде лент на поверхность жидкости в прикрепленной к ножу ванночке, откуда их надо перенести на сеточки.
Контрастирование (или окрашивание) срезов проводят с помощью солей тяжелых металлов (свинца, вольфрама, урана). Содержащиеся в этих соединениях элементы с высокой атомной массой осаждаются на фосфолипидах клеточных мембран и не пропускают электронный луч, вследствие чего эти участки клетки выглядят на экране более темными, контрастными по сравнению с другими участками, не содержащими фосфолипидов.
Для ориентировки в изучаемом объекте используют метод изготовления полутонких срезов (1—2 мкм) с последующим окрашиванием (метиленовым синим или толуидиновым синим). Окрашенный срез рассматривают с помощью микроскопа для определения области, которая должна быть изучена на ультрамикроскопическом уровне, и в дальнейшем с этого участка прицельно готовят ультратонкие срезы.
Методика обработки материала для электронно-микроскопического исследования
1. Быстрое взятие материала.
2. Фиксация в 2—4 % забуференном растворе глутаральдегида в течение 1ч.
3. Промывка материала буферным раствором (рН 7,3—7,4) 3 раза по 30 мин.
4. Постфиксация в 1 % растворе тетраоксида осмия в течение 1—2 ч.
5. Промывка материала буферным раствором 3 раза по 30 мин.
6. Обезвоживание в спиртах восходящей концентрации (70 %, 90 %, 100 %) по 10 мин, в 100 % — 2 раза по 15 мин.
7. Пропитывание материала заливочной средой, состоящей из эпоксидных смол, до 24 ч.
8. Заливка материала эпоксидными смолами с добавлением катализатора и последующим помещением его в термостат (60 °С) для полимеризации до 24 ч.
9. Заточка и резка блока.
10. Окрашивание срезов:
а) получение полутонких срезов и окрашивание их метиленовым синим;
б) получение ультратонких срезов с последующим окрашиванием их (контрастированием) раствором уранилацетата (1—2 ч), а затем раствором цитрата свинца (20—30 мин).
Записать или зарисовать в альбом.
Требования, предъявляемые к гистологическому препарату
Основные этапы приготовления гистологических препаратов.
Методы окрашивания и основные типы красителей.
Требования при работе с микроскопом.
Методы исследования, применяемые в гистологии, цитологии, эмбриологии.
Выполнение самостоятельных контрольных работ.