3.4. Просвечивающая электронная микроскопия
Размер и дисперсный состав наночастиц определялся на микроскопе высокого разрешения JEOL JEM-1011, являющегося наиболее оптимальным для исследования наночастиц такого размера (5-20 нм) с последующей обработкой данных.
3.5.Измерения протонно-релаксационных свойств нчож.
Мы изучали времена спин-спиновой релаксации (Т2) протонов в образцах на ЯМР-релаксометре РС-120 фирмы «Брукер».
Рис. 4. Ямр-релаксометр серии minispec mq фирмы «Брукер».
ЯМР-релаксометр для измерения времён релаксации Т1 и Т2
в биологических жидкостях в составе:
1. Управляющий электронный блок с высокочастотным передатчиком.
Качественные характеристики:
- закрытая, не требующая обслуживания система с воздушным охлаждением, с экранированием от электромагнитных помех, со светодиодной индикацией для диагностики подключения и напряжения на блоке питания
- встроенный центральный процессор с возможностью управления в режиме реального времени, динамическое ОЗУ и флэш-ПЗУ для встроенного ПО
- 10 Мб Ethernet адаптер для соединения с локальным ПК и загрузки встроенного ПО. Полностью удаленный контроль с помощью ПО.
- прямой цифровой радиочастотный генератор и импульсный программатор, частотный диапазон 2-65 MHz, с шагом 1 Hz. Восемь свободных программируемых вспомогательных импульсных каналов. Генерация 0°, 90°, 180° и 270° импульсов, с фазовым разрешением лучше, чем 0.2°
- возможность внешнего включения/выключения
2. Магнитная закрытая система на базе магнита частотой 20 МГц, 470 мТл, с внутренней воздушной циркуляцией и автоматизированной системой поддержки температуры 35-45 Сº, точность поддержания температуры лучше чем 0.01 Сº
- быстрая смена измерительных датчиков
- автоматическое распознавание измерительных датчиков
- автоматическое распознавание ампулы с образцом
- расстояние между полюсами магнита 33 мм
- возможность работы с измерительными датчиками 1H и 19F
3.Измерительный датчик:
- Измерительный датчик на 1H, для магнитной системы 20 МГц, для относительных измерений, позволяющий работать с пробирками диаметром 10 мм.
-датчик поставляется со специальными проверочными образцами для тестирования их работоспособности и настроек прибора.
4. Лицензионное программное обеспечение.
ПО должно позволять управлять магнитными системами, осуществлять их тестирование, программировать импульсные последовательности, сохранять их, с возможностью использовать в дальнейшем, строить калибровки и зависимости, выводить на экран результаты, создавать и печатать протоколы результатов анализа, контролировать и управлять периферийными устройствами.
Методика измерений – импульсная последовательность КПМГ(90°-(τ-180°-τ)n). Кривые спада измерялись в 10 точках (временной диапазон 0,3-30млсек). Накопление сигнала 4 – кратное. Времена спин-решеточной релаксации измерялись с помощью импульсной последовательности –( 180°-τ-90°), количество точек – 10.
3.6.Клеточная культура фибробластов крысы.
Для оценки цитотоксичности исследуемых соединений были выбраны фибробласты теменной кости крысы. Фибробласты легко поддаются культивации in vitro и являются стандартным объектом при доклинических испытаниях[21].
Для получения культуры извлекали в асептических условиях ламинарбокса теменную кость новорожденной крысы, измельчали стерильными ножницами на фрагменты 1- 2мм3 . Затем среду с фрагментами ткани наносили на дно плоскодонных культуральных пластиковых флаконов «Costar» Использовали стандартную среду DMEM с добавлением 20% ермоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл и антибиотика – гентамицина сульфата – в концентрации 40 мкг/мл.
Через неделю наблюдали образование на поверхности флакона участков клеточного монослоя, растущего из прикрепленных фрагментов. Клетки для равномерного распределения подвергали обработке трипсином и еще через 1 неделю получали монослойную культуру (рис.9)
Рис.5. Монослойная культура клеток нормальных фибробластов
Культивирование клеток осуществлялось в пластиковых флаконах в стерильных условиях, клетки инкубировались при 37ºС в условиях 5% СО2. При культивировании клеток использовали стандартную среду DMEM с добавлением 20% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл и антибиотиков – гентамицина сульфата и стрептомицина сульфата – в концентрации 40 мкг/мл.
Работа с клетками производилась в асептических условиях с использованием ламинарного бокса ЛС (Россия). При перенесении клеток из одного флакона в другой, или из флакона в планшет, производились следующие операции: сначала из флакона удалялась среда. Затем, оставшийся монослой клеток промывался 2 раза раствором Версена, и 2 раза 0,25% раствором трипсина, после чего флакон с остатками трипсина на слое клеток помещался в термостат, при температуре 37 С на 3-5 мин. После такой обработки, клетки теряли сцепление с поверхностью флакона, что позволяло смыть их струей среды из шприца, и получить суспензию, которую затем переносили в другой флакон или планшет.