- •«Российский национальный исследовательский медицинский
- •3.4. Просвечивающая электронная микроскопия……………………………...34
- •2. Обзор литературы
- •2.1. Наночастицы магнетита, их свойства и возможности использования в фармакологии и медицине.
- •2.1.1. Наночастицы магнетита, основные свойства.
- •2.1.2. Магнитные свойства нчож. Суперпарамагнетизм и ферримагнетизм.
- •2.2.Протонная релаксометрия.
- •2.3. Применение наночастиц магнетита в качестве основы для контрастного средства при мрт диагностике.
- •2.3.1. Метод мрт-диагностики.
- •2.3.2.Клиническое применение мрт.
- •2.3.3. Показаниями для проведения мрт с контрастным средством.
- •2.3.4. Противопоказания к мрт
- •2.4. Классификация магнитно-резонансных контрастных средств.
- •2.5. Взаимодействие наночастиц оксида железа с клетками. Роль стабилизации.
- •3.Материалы и методы.
- •3.1. Методика экспериментального исследования
- •3.2.Исследуемые соединения и реактивы.
- •3.3. Методика получения суперпарамагнитных и ферримагнитных
- •3.4. Просвечивающая электронная микроскопия
- •3.5.Измерения протонно-релаксационных свойств нчож.
- •3.6.Клеточная культура фибробластов крысы.
- •3.7.Мтт-тест
- •3.8. Методы статистической обработки данных.
- •4. Результаты и их обсуждение.
- •4.1.Синтез растворов на основе наночастиц.
- •4.2.Анализ кривых спада времен релаксации.
- •4.3.Оценка влияния соединений железа на жизнеспособность фибробластов мтт-тестом.
2.5. Взаимодействие наночастиц оксида железа с клетками. Роль стабилизации.
Низкая токсичность – одно из определяющих свойств лекарственного средства. Способов вызвать токсический эффект у наночастиц, например железа, больше, чем у растворимых веществ. Кроме токсичности, присущей веществам, входящим в состав наночастицы, токсичность может быть связана с размером, формой, свойствами поверхности наночастицы. Наночастицы обладают высокоразвитой активной поверхностью и, как следствие, высокой сорбционной емкостью. Благодаря своим размерам (менее 100 нм), сопоставимым с размерами клеток (10—100 мкм), вирусов (20—450 нм), белков (5—50 нм), ДНК (2 нм шириной, 10—100 нм длиной), наночастицы могут приближаться к биообъекту, взаимодействовать и связываться с ним[29].
Для биомедицинского применения наночастиц необходимо выполнить ряд требований: образовать устойчивую коллоидную систему в водных растворах и других биосовместимых растворителях, иметь возможность вариации параметров раствора (концентрации солей, рН и температуры) в интервалах, которые определяются целью исследования в каждом конкретном случае. Однако ввиду высокой реакционной активности для наночастиц практически не существует инертной среды. Одной из особенностей поведения наночастиц в растворе является их склонность к агрегации, поэтому практическое использование растворов наночастиц сопряжено с их стабилизацией (нанесение покрытия на поверхность магнитного «ядра», добавление стабилизаторов, подбор растворителей и т.д.)[27].
Применяемые покрытия можно разделить на органические (сурфактанты и полимеры) [1,20] и неорганические (кремнезем, углерод, благородные металлы)[8,]. Наиболее распространенными органическими покрытиями наночастиц являются декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ), крахмал, поливинилэтанол, гепарин, высшие карбоновые кислоты, в том числе лимонная кислота[10,11,14,25,26].
Помимо защиты от агрегации, окисления, кислотной и щелочной коррозии покрытие может играть роль спейсера для присоединения фармацевтических агентов или биомолекул к магнитному носителю. Благодаря покрытию можно модифицировать поверхность наночастиц различными функциональными группами — азидо-, амино-, карбоксильными, сульфгидрильными, гидроксильными, имидными и другими, что позволяет ковалентно связывать наночастицы с биомолекулами или лекарственными средствами[2]. Образование ионной связи наночастиц с противоопухолевыми препаратами может быть достигнуто в результате нанесения на наночастицы (уже покрытые полимером с целью стабилизации коллоидного раствора) второго слоя полимеров, поли-DL-лактид-ко-гликолида (PLGA), полилактида (PLL) или дендримеров[9]. Дополнительной важной функцией покрытия наночастиц является повышение их биосовместимости.
Так, показано, что покрытие декстраном препятствует опсонизации магнитных наночастиц клетками ретикулоэндотелиальной системы при введении их в кровоток[23,13]. Поверхностная модификация ПЭГ снижает поглощение наночастиц макрофагами и благодаря наличию полярных и неполярных группировок способствует эффективному проникновению через мембрану клетки.
Такой стабилизатор как лимонная кислота не обладает сильными поверхностно- активными свойствами, так как мала СН цепочка, но приемлема с биологической точки зрения, так как данная кислота-участник цикла Кребса, что способствует ускорению биохимического метаболизма. Также показано, что лимонная кослота обладает низкими токсическими свойствами.
Важно отметить, что иммобилизация на поверхности наночастицы приводит к стабилизации биомолекул и служит защитой от деградации их под воздействием различных факторов. Показано, что ДНК, иммобилизованная на поверхности наночастицы[28], сохраняет свою стереометрию и устойчива к действию нуклеаз[5,7]. При иммобилизации белков и ферментов на магнитных частицах их стабилизация достигается главным образом за счет стабилизации конформационной структуры и за счет предотвращения ферментативной деградации[8,15]. Благодаря малым размерам соединение с наночаcтицей не приводит к денатурации белковых молекул, что очень важно для сохранения функциональной активности и аффинитета к мишени, например при нацеливании посредством антител[12]. При поиске МРКС исследователи обратили внимание на наночастицы оксида железа, обладающие достаточной контрастирующей способностью. Среди железосодержащих МРКС выделяют: SPIO – суперпарамагнитный оксид железа; USPIO - суперпарамагнитный оксид железа в виде ультрамалых частиц и MIOH – монокристаллический оксид железа.
Препараты SPIO (Fe23+O3) имеют кристаллическую структуру и сильно ускоряют протонную релаксацию тканей. Диаметр частиц SPIO меньше эритроцита, что позволяет им проникать через капиллярную сеть. Разработанные препараты SPIO имеют необходимые величины заряда и размера для избирательного поглощения клетками ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС). После деградации SPIO и РЭС атомы железа включаются в состав гемоглобина эритроцитов. Количество железа, поступающего в организм в составе SPIO при диагностике, значительно ниже общей величины депо железа.
Препараты SPIO относятся к тканеспецифическим МРКС, имея тропность к РЭС и позволяя контрастировать важные органы человеческого организма( печень, селезенка, костный мозг).