В составе полиплексов

Для введения в клетку ДНК-конструкций больших размеров (>10 т.п.н.) используют полиплексы — системы, состоящие из положительно заряженных полимеров (поликатионов) и отрицательно заряженных молекул ДНК. Размер таких комплексов составляет менее 100 нм, что, с одной стороны, не отдаёт их на переваривание макрофагам (поскольку они реагируют на частицы более 200 нм), а с другой стороны, они достаточно большие, чтобы не фильтроваться в почках.

Поликатионы конденсируют молекулу ДНК в комплексы, и таким образом обеспечивают её стабильность и защиту от действия нуклеаз. В качестве ДНК-связующих полимеров могут служить катионные белки, синтетическиегомополимеры аминокислот (полилизины, полиаргинины), полисахарид хитозан, полиэтиленамин. Обычно в составе полиплексов поликатион находится в избытке, в результате чего данный комплекс является растворимым и положительно заряженным. Если к полиплексу пришить лиганд к определённому клеточному рецептору, то ДНК-вакцину можно направлять в конкретный тип клеток. Процесс доставки генетического материала в составе полиплексов включает два этапа: внеклеточный (путь от места введения к клеткам-мишеням) и внутриклеточный (взаимодействие с клетками-мишенями,эндоцитоз, выход из эндосом, доставка в ядро). Первым барьером, который необходимо преодолеть комплексу, являетсякровь и внеклеточный матрикс. Поэтому подбираются такие физико-химические параметры полиплекса, чтобы увеличить его стабильность, избежать нежелательных взаимодействий с белками крови и иммунной реакции, вызванной химической природой поликатиона. Попав в клетки-мишени, полиплекс адсорбируется на плазматической мембране, поглощается путём эндоцитоза, после чего он должен покинуть эндосому и диссоциировать на катионный полимер и молекулу ДНК. Свободная ДНК направляется в ядро, а катионый полимер покидает клетку и выводится из организма.

Характеристика наиболее распространённых методов доставки ДНК-вакцин[18][16]
Метод	Преимущества	Недостатки
Внутримышечные или подкожные инъекции	Не требуется специального оборудования Постоянная или длительная экспрессия ДНК разносится по близлежащим тканям	Низкая эффективность Нужно относительно большое количество ДНК
Электропорация	Высокая эффективность	Повреждение тканей
Генный пистолет	Высокая точность Требуется небольшое количество ДНК	Требует наличия инертных микрочастиц Повреждение клеток в месте выстрела
Введение за счёт высокого давления	Относительно простой метод Отсутствует потребность в микрочастицах ДНК может проникать на глубину от нескольких мм до 1,5 см	Влияет на структуру ДНК Низкая эффективность иммунизации Требует большого количества ДНК (до 300 мкг)
Упаковка в липосомы	Высокая эффективность in vitro Простота изготовления Большая ёмкость Можно сочетать с другими методами При внутривенном введении вакцина потенциально может попадать во все ткани Интроназальный ввод обеспечивает экспрессию вакцины в слизистой оболочке носа и выработку иммуноглобулинов класса А (IgA)	Возможная токсичность Низкая эффективность in vivo

Механизм развития иммунного ответа[

Синтезированный в клетке антиген поддаётся процессингу, после чего происходит его представление иммунокомпетентным клеткам. Процессинг — это расщепление антигенного протеина на иммуногенные пептидные фрагменты. Представление означает подачу фрагмента антигена, соединённого с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) иммунокомпетентным клеткам. Различают два наиболее значимых класса этих молекул: ГКГ класса I (ГКГ-I) и ГКГ класса II (ГКГ-II). Для связывания с молекулами каждого класса антиген проходит подготовку в специализированных компартментах клетки. Эндогенные белки-антигены направляются на деградацию в протеасому, после чего представляются в комплексе с ГКГ-I на поверхности клетки. Здесь при встрече их распознают CD8+ T-клетки(Т-киллеры), которые реализуют цитотоксический иммунный ответ. Экзогенные белки расщепляются лизосомными протеазами, включаются в состав ГКГ-II и распознаются рецепторами CD4+ Т-клеток (Т-хелперов). Последние вызывают как клеточный, так игуморальный ответ.

Пути процессинга антигена и формы иммунного ответа
Локализация антигена	Основной инструмент процессинга	Антигенпредставляющий комплекс	Клетки, которые распознают комплекс антиген-ГКГ	Иммунный ответ
В клетке	Протеасома	ГКГ-I	Т-киллеры	Цитотоксический
Вне клетки	Лизосома	ГКГ-II	Т-хелперы	Клеточный, гуморальный

Презентация антигена по пути ГКГ-I[

Схема презентации антигена по пути ГКГ-I

ДНК-вакцинация предполагает эндогенный синтез антигена, поэтому этот путь является преобладающим. Процессинг антигена по пути ГКГ-I проходит в несколько этапов. Синтезированный в ядре белок транспортируется в цитоплазму, расщепляется протеасомой на короткие пептиды — эпитопы, которые специальными белками-транспортёрами антигенов (англ. ТАР, transporter associated with antigen processing) переносятся в эндоплазматический ретикулум(ЭПР). В ЭПР каждый эпитоп соединяется с молекулой ГКГ-I, после чего образованный комплекс направляется в аппарат Гольджи на гликозилирование. Оттуда комплекс в составе везикулы направляется к плазматической мембране. После слияния везикулы с плазмалеммой комплекс оказывается на поверхности клетки, где распознается рецепторами Т-киллеров, которые обладают цитотоксической активностью.

Презентация антигена по пути ГКГ-II[

Основным источником пептидов, которые связываются с ГКГ-II, являются экзогенные белки, которые попали в клетку с помощью эндоцитоза. Однако показано, что некоторые внутриклеточные белки также могут быть представлены в комплексе с ГКГ-II. При этом новосинтезированные белки после попадания в цитоплазму переносятся в лизосомы, где антиген расщепляется под действием кислых протеаз. После этого лизосома, которая содержит эпитопы, сливается с везикулой, которая несёт молекулу ГКГ-II. Внутри объединённой везикулы образуется комплекс эпитоп-ГКГ-II, который после слияния везикулы с плазмалеммой выносится на поверхность клетки. Здесь этот комплекс распознается рецепторами Т-хелперов, в результате чего происходит их активация. Это приводит к стимуляции как клеточного (активация Т-киллеров), так и гуморального иммунитета (активация В-лимфоцитов).

Традиционная вакцинация растворимыми белковыми антигенами нацелена на мобилизацию T-хелперов. Сравнительно низкий ответ Т-хелперов является одним из недостатков ДНК-вакцин. Также нынешнее поколение ДНК-вакцин не способно индуцировать продукцию высоких титров антител. Чтобы повысить активацию Т-хелперов, антиген нужно перенаправить на путь ГКГ-II. Для этого в ДНК-вакцину встраивают сигнал лизосомной локализации: синтезированный антиген будет направляться в лизосомы, а значит ступать на путь ГКГ-II.

Стратегии повышения эффективности ДНК-вакцины

Главный вопрос относительно будущего ДНК-вакцин касается повышения их эффективности. На сегодня проводится большое количество исследований, посвящённых оптимизации разработанных ДНК-вакцин. Поиск решения ведётся в двух направлениях: повышение экспрессии вакцины и увеличение иммуногенности закодированного антигена.