Электропорация

Принцип действия электропорации. Электрический ток перегруппировываетлипиды плазмалеммы таким образом, что образуется гидрофильный (сверху) илигидрофобный (снизу) канал. Прохождение гидрофильной молекулы ДНК возможно только через верхний вариант поры.

Электропорация — традиционный подход для доставки ДНК в бактериальные клетки и культуры клеток, который базируется на применении электрического импульса. Такой импульс создает поры в клеточной мембране, что способствует вхождению отрицательно заряженной ДНК. Этот способ был заимствован для доставки ДНК-вакцины в организм животных и человека и позволяет значительно повысить эффективность обычной инъекции. Прибор для электропорации имеет источник электрического тока и одноразовую сетку, которая состоит из шприца и игл-электродов. Шприц вводит вакцину в мышечную ткань, а электроды создают электрическое поле, которое облегчает вхождение ДНК в миоциты и дендритные клетки. На сегодня разработаны устройства, которые позволяют повысить эффективность вакцинации в 1000 раз по сравнению с обычной инъекцией. Электропорацию можно применять как для внутримышечного, так и для подкожного введения ДНК-вакцины. Недостатками являются незначительная болезненность в месте инъекции, потребность в специализированных устройствах. Вместо электрического поля можно использовать магнитное. Такие устройства действуют по тому же принципу, однако в этом случае процедура является полностью безболезненной и менее повреждает клетки^].

Действие электрического поля не только усиливает поглощение ДНК-вакцины клетками, но и стимулирует выработку иммунного ответа. Применение электропорации приводит к незначительному повреждению ткани — развивается локальный воспалительный процесс. Поврежденные клетки выделяют хемокины, поэтому к ним направляются макрофаги, лимфоциты и дендритные клетки. Увеличение концентрации иммунных клеток в месте введения вакцины повышает её эффективность.

Сонопорация

Сонопорация — метод переноса чужеродной ДНК в клетки с помощью ультразвука. Ультразвук увеличивает проницаемость клеточной мембраны, вследствие чего экзогенная ДНК легче проникает в клетку. Впервые сонопорация для переноса генов в клетку была применена в 1986 году. Этот метод применяется для ввода молекул ДНК в клетки роговицы, мозга, костнойткани, почек, поджелудочной железы, эмбриональной ткани, скелетной и сердечной мышц. Относительно других методов сонопорация является малоисследованной, необходимо ещё немало усилий, чтобы повысить её эффективность, особенно на уровне целого организма.

Баллистическая трансфекция

Баллистическая трансфекция основывается на обстреливании (бомбардировке) органов и тканей микрочастицами тяжёлых металлов (золото, вольфрам) диаметром 1-3 мкм, покрытых молекулами ДНК. Введённая таким образом ДНК-вакцина экспрессируется в клетках-мишенях, а их продукты попадают в кровь. Для придания ускорения частицам используются похожее на стрелковое оружие устройство — генный пистолет, или генную пушку. Микрочастицы проходят через клеточные мембраны и переносят генетическую конструкцию непосредственно в ядро клетки. Глубина проникновения микрочастиц, как правило, невелика — до 1 мм, поэтому метод применяют преимущественно для трансфекции кожи или прилегающейхрящевой ткани. Особые условия обстрела позволяют микрочастицам проникать на глубину до 4-5 мм и переносить генные конструкции в волокна поперечно-полосатых мышц. Обычно клетки, находящиеся непосредственно по центру выстрела, погибают, в то время когда в зоне 0,6-1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Эту технологию называют также биобаллистикою или биолистикой.

Первый генный пистолет был создан группой учёных в период 1983 и 1986 годами с целью трансформации клеток растений. Это был пистолет, разработанный на основе устройства для автоматического забивания гвоздей. На вольфрамовый шар наносили ДНК с репортёрным (маркерным) геном и выстреливали им чашку Петри. Экспрессия репортёрного гена свидетельствовала об эффективности иммунизации. На сегодня для доставки ДНК используют частицы из золота илисеребра, так как они не являются токсичными для клетки, в отличие от вольфрамовых.