Molekuljarnaja Biologija Kletki v3

261

Рис. 18-46. Т-клеточный рецептор -гетеродимер, состоящий из полипептидных цепей α и β обе цепи гликозилированы (не показано). Каждая из цепей имеет длину в 280 аминокислот; большая внеклеточная часть каждой цепи свернута в два Ig-подобных домена - один вариабельный (V) и один константный (С). Исходя из анализа аминокислотных последовательностей (выведенных из последовательностей клонированных кДНК), полагают, что антиген-связывающий участок, образуемый доменами Vα и Vβ, по общим размерам и геометрии сходен с антиген-связывающим участком молекулы антитела. Однако в отличие от антител, имеющих два участка для связывания антигена, Т-клеточные рецепторы имеют лишь один такой участок (вероятно, потому, что они всегда связаны с плазматической мембраной, где могут действовать кооперативно). Показанный здесь α/β-гетеродимер нековалентно ассоциирован с инвариантным набором мембранных белков - так называемым комплексом CD3 (не показан).

Типичная Т-клетка имеет на своей поверхности от 20000 до 40000 α/β-белков.

молекулы названы так потому, что они кодируются комплексом генов, получивших название главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC) (см. разд. 18.6.5). В результате активация Т-клеток происходит только при их контакте с другой собственной клеткой; это наиболее важное различие между процессами узнавания антигена Т- и В-клетками.

18.6.1. Т-клеточные рецепторы представляют собой антителоподобные гетеродимеры [32]

Поскольку Т-клетки активируются только в результате тесного контакта с другими клетками, их рецепторы для антигенов существуют только в мембраносвязанной форме. Поэтому такие рецепторы было трудно выделить - в отличие от антител, которые секретируются (но могут быть и мембраносвязанными), и значительно больше времени потребовалось на то, чтобы идентифицировать эти молекулы и кодирующие их гены, Первые рецепторные белки были выделены в 1983 г., после того как стало возможным выращивать в культуре чистые клоны антигенспецифических Т-клеток (разд. 18.6.11), что позволило иметь большие количества Т-клеток с идентичными рецепторами. Затем могли быть получены моноклональные антитела против клонированных клеток, и те из них, которые узнают Т-клеточный рецептор, были идентифицированы по их способности блокировать вызванные антигеном ответы исходных клеток, но не ответы других Т-клеточных клонов. Эти антитела были затем использованы для очистки молекул рецепторов; оказалось, что рецептор состоит из двух полипептидных цепей α и β, соединенных дисульфидными связями. Каждая из этих цепей имеет отличительную особенность, общую у них с антителами, - наличие вариабельной N-концевой и константной С-концевой областей (рис. 18-46).

Примерно год спустя эти черты сходства с антителами стали важным элементом остроумного способа выделения генов, кодирующих Т- клеточные рецепторы. Т- и В-лимфоциты близко родственны, поэтому большинство генов транскрибируется у них одновременно, и, значит, они содержат в основном одни и те же мРНК; однако мРНК для Т-клеточного рецептора содержат только Т-клетки. Исследователи взяли суммарную мРНК Т-клеточных клонов, гибридизацией на истощение удалили мРНК, содержащуюся также и в В-клетках (разд. 5.6.4), и получили небольшую популяцию мРНК, свойственную только Т-клеткам, Затем из этой мРНК приготовили библиотеку кДНК (разд. 5.6.3) и использовали индивидуальные клоны кДНК из этой библиотеки дм получения радиоактивных ДНК-зондов. Предполагая, что вариабельность N-концов Т- клеточных рецепторных белков (как и V-областей антител) создается путем перестроек ДНК, каждый из ДНК-зондов использовали затем для анализа соответствующих геномных ДНК в попытке выявить перестройки в процессе развития Т-клеток. Таким путем в конце концов были локализованы (на разных хромосомах) генные пулы, кодирующие α- и β-цепи. Было показано, что эти пулы, та же как и генные пулы для антител, содержат отдельные V-, D-, J- и С-сегменты, которые объединяются путем сайт-специфической рекомбинации в процессе развития Т-клеток в тимусе.

За одним исключением, все механизмы, используемые В-клетками для создания разнообразия антител, используются также и Т-клетками для создания разнообразия Т-клеточных рецепторов. Полагают, однако, что у Т-клеток особенно важную роль играют механизмы, связанные с выпадением и вставкой нуклеотидов при соединении генных сегментов, Но зато здесь, по-видимому, не используется механизм соматического гипермутирования, приводимый в действие антигеном (разд. 18.4,4).

262

Причина этого, возможно, состоит в том, что при гипермутировании могли бы возникать Т-клетки, реагирующие со «своими» молекулами. Такого рода проблема гораздо менее существенна для В-клеток, так как большая часть В-клеток, реагирующих на «свое», не могла бы активироваться без помощи реагирующих на «свое» Т-клеток-хелперов (разд. 18.6.12).

Недавно были обнаружены Т-клеточные рецепторы второго типа-гетеродимеры, состоящие из γ- и δ-цепей. Эти рецепторы экспрессируются на субпопуляциях клеток с неизвестными функциями в тимусе, эпидермисе и кишечном эпителии.

Как α/β-, так и γ/δ-Т-клеточные рецепторы физически ассоциированы на поверхности клетки с одним и тем же набором полипептидных цепей - так называемым комплексом ТЗ (или CD3). Этот комплекс имеется на поверхности всех зрелых Т-клеток. Полагают, что он участвует в передаче сигнала от активированного антигеном Т-клеточного рецептора внутрь клетки.

18.6.2. Различные ответы Т-лимфоцитов опосредуются разными классами этих клеток [33]

Т-лимфоциты убивают клетки, инфицированные вирусами, а также способствуют или противодействуют ответам других лейкоцитов. Эти три функции осуществляются разными классами Т-лимфоцитов - цитотоксическими Т-клетками, Т-клетками-хелперами (или индукторами) и Т-

клетками-супрессорами соответственно. Цитотоксические Т-клетки вместе с В-клетками - это главные эффекторные клетки иммунной системы; Т- хелперы и Т-супрессоры вместе называют Т-клетками-регуляторами.

Из трех основных классов Т-клеток мы меньше всего знаем о Т-супрессорах. Известно, например, что Т-хелперы и цитотоксические Т- клетки используют для узнавания антигена одни и те же рецепторы (α/β-гетеродимеры), тогда как природа рецепторов, используемых Т- супрессорами, пока неясна (хотя по крайней мере некоторые из них, видимо, тоже используют α/β-гетеродимеры). Одна из причин ограниченности наших знаний о Т-супрессорах состоит в том, что было чрезвычайно трудно получить в культуре клоны этих клеток, в то время как получать антиген-специфичные клоны цитотоксических Т-клеток и Т-хелперов сравнительно легко (разд. 18.6.11).

Хотя цитотоксические Т-клетки и Т-хелперы используют антигенные рецепторы, кодируемые одними и теми же пулами генных сегментов, они не могут узнавать одни и те же молекулы МНС на поверхности клеток. Такое различие отражает разные функции клеток этих двух типов.

18.6.3. Цитотоксические Т-лимфоциты убивают клетки, инфицированные вирусами [34]

Вирусы воспроизводятся внутри клеток, где они укрыты от воздействия антител; поэтому наиболее эффективный способ предотвратить их распространение на другие клетки состоит в том, чтобы убить инфицированную клетку еще до начала сборки вируса. Это и есть основная функция цитотоксических Т-клеток. Ввиду высокого разрушительного потенциала этих лимфоцитов чрезвычайно важно, чтобы их атака была ограничена только инфицированными клетками. Как показала микрокиносъемка, цитотоксическая Т-клетка в каждый данный момент может сосредоточить свою атаку лишь на одной клетке-мишени, даже если

263

Рис. 18-47. Цитотоксическая Т-клетка (меньшая из двух) и убиваемая ею в культуре клетка-мишень. А и Б электронные микрофотографии; В- картина иммунофлуоресценции после окрашивания антителами к тубулину. Цитотоксические Т-клетки были взяты у мышей, иммунизированных клетками-мишенями -чужеродными опухолевыми клетками. Показано, как Т-клетка и клетка-мишень связываются друг с другом (А, В); на фото Б- Т-клетка после того, как она убила клетку-мишень. Обратите внимание, что у Т-клетки, но не у клетки-мишени центросома и расходящиеся от нее микротрубочки ориентированы в точку межклеточного контакта (А и Б из D. Zagury et al., Eur. J. Immunol., 5, 818-822, 1975; В из В. Geiger et al., J.

Cell Biol., 95, 137-143, 1982. Copyright permission of the Rockefeller Univ. Press.)

с нею связалось несколько клеток-мишеней. Каким же образом цитотоксическая клетка так точно направляет свою атаку?

По-видимому, направляющий механизм зависит от перестройки цитоскелета цитотоксической клетки в результате специфического контакта с поверхностью клетки-мишени. Если цитотоксическую Т-клетку во время ее взаимодействия с атакуемой мишенью пометить антителами к тубулину, то можно увидеть, что ее центросома ориентирована в точку контакта с клеткой-мишенью (рис. 18-47). Кроме того, если клетку пометить антителами к талину - белку, участвующему, видимо, в соединении рецепторов клеточной поверхности с кортикальными актиновыми филаментами (разд. 11.2.8), то окажется, что талин сконцентрирован в кортексе цитотоксической клетки в месте контакта. Имеются данные в пользу того, что агрегация Т-клеточных рецепторов в участке контакта приводит к локальному талин-зависимому скоплению актиновых филаментов; затем механизм, зависимый от микротрубочек, ориентирует центросому и связанный с нею аппарат Гольджи к участку контакта, направляя воздействие убивающего аппарата на клетку-мишень. Аналогичную поляризацию цитоскелета можно наблюдать и при функциональном взаимодействии Т-хелпера с клеткой, которой он «помогает».

18.6.4. Как цитотоксические Т-клетки убивают свои мишени? [35]

Цитотоксические клетки защищают нас не только от обычных вирусных инфекций, но и от опухолей вирусного происхождения. Однако такие опухоли составляют, вероятно, менее 20% всех злокачественных опухолей человека. Кроме того, имеющиеся данные никак не свидетельствуют в пользу того, что иммунные ответы защищают нас и от большинства других видов рака: в условиях иммуносупрессии люди и экспериментальные животные более подвержены вирусным опухолям (а также опухолям предполагаемой вирусной природы), но этого нельзя сказать о спонтанных и химически индуцированных опухолях. Большой интерес вызывает, однако, возможная роль неиммунологических механизмов в защите от рака. Опухолевые клетки могли бы уничтожаться макрофагами или естественными клетками-киллерами (NK, natural killer cells). NK-клетки

264

представляют собой лимфоцитоподобные клетки, вероятно, такого же рода, что и К-клетки, которые убивают эукариотические клетки, покрытые антителами (разд. 18.2.5). Но в отличие от К-клеток NK-клетки могут также спонтанно и относительно неспецифически убивать многие опухолевые и инфицированные вирусами клетки в культуре в отсутствие антител. Как они в этих случаях отличают аномальные клетки от нормальных, не известно.

Мы не знаем, каким образом цитотоксические Т-клетки и NK-клетки убивают свои мишени. Некоторые линии NK-клеток и цитотоксических Т-клеток, которые можно неопределенно долго поддерживать в культуре, используют для этого механизм, вероятно, сходный с действием системы комплемента. Связывание с мишенями ведет к высвобождению этими клетками порообразующих белков, называемых перфоринами, которые полимеризуются в плазматической мембране клетки-мишени, превращаясь в трансмембранные каналы. Как полагают, эти каналы делают мембрану проницаемой, что способствует гибели клетки. Перфорины, которые гомологичны компоненту комплемента С9, хранятся в секреторных пузырьках и освобождаются путем локального экзоцитоза в месте контакта с клеткой-мишенью. В секреторных пузырьках содержатся также сериновые эстеразы, однако играют ли они какую-либо роль в гибели клетки-мишени, неизвестно. На электронных микрофотографиях перфориновые каналы в мембране клеток-мишеней выглядят очень сходно с каналами, образуемыми компонентом С9, и это подкрепляет мысль о сходстве механизмов действия цитотоксических клеток и комплемента. Однако обычные цитотоксические Т-лимфоциты и NK-клетки могут убивать клетки-мишени и без участия перфоринов, с помощью какого-то механизма, молекулярная основа которого не известна. Одна из возможностей состоит в том, что эти клетки активируют в клетке-мишени некий внутренний механизм саморазрушения, который приводит ее к «самоубийству».

Какие молекулы узнают NK-клетки на убиваемых ими мишенях, неизвестно. Между тем выяснено, что цитотоксические Т-клетки узнают вирусные молекулы, связанные с гликопротеинами МНС на поверхности клеток, инфицированных вирусами. Однако лишь недавно установлена решающая роль молекул МНС в «представлении» антигена Т-клеткам.

18.6.5. Молекулы МНС определяют отторжение трансплантата [36]

О молекулах МНС было известно задолго до того, как стала понятна их нормальная функция. Они были первоначально определены как главные антигены-мишени в реакциях на трансплантат. Пересадка ткани взрослого донора особи того же вида (аллотрансплантация) или иного вида (ксенотрансплантация) приводит обычно к ее отторжению. Эксперименты по пересадке кожи между разными линиями мышей, проведенные в 50-х годах, показали, что отторжение трансплантата обусловлено иммунной реакцией на чужеродные антигены, находящиеся на поверхности его клеток. Позднее было показано, что в этих реакциях участвуют главным образом Т-клетки и что они направлены против генетически «чужеродных» вариантов гликопротеинов клеточной поверхности, получивших название молекул гистосовместимости (т.е. совместимости тканей). Из них особенно большое значение имеют главные молекулы гистосовместимости - семейство гликопротеинов, кодируемое генами, составляющими главный комплекс гистосовместимости (МНС). Молекулы МНС имеются на поверхности клеток всех высших позвоночных. Впервые они были найдены у мышей и названы антигенами Н-2 (histocompatibility-2). У человека они носят название HLA

266

Рис. 18-49. Молекулы гликопротеинов МНС класса I (А ) и класса II (Б). α-цепь молекулы класса I длиной около 345 аминокислотных остатков имеет три внеклеточных домена, α1 , α2 и α3, кодируемых отдельными экзонами. Молекула нековалентно связана с полипептидной цепью меньших размеров - β2 микроглобулином (96 аминокислот), который не кодируется в МНС. Домен α3 и β2-микроглобулин гомологичны доменам иммуноглобулинов. β2- Микроглобулин инвариантен, однако α-цепь чрезвычайно полиморфна - главным образом это относится к доменам α1 и α2. Путем создания (методами генетической инженерии) гибридных генов, содержащих в одном локусе смесь экзонов α1 , α2 и α3 из разных аллелей, и последующей трансфекции этими генами культивируемых фибробластов было показано, что антигенные детерминанты, узнаваемые Т-клетками, формируются путем взаимодействия

доменов α1 и α2

В составе молекул МНС класса II полиморфны обе цепи (3 в большей степени, чем а), главным образом за счет доменов α1 и β1. Домены α2 и β2 гомологичны доменам иммуноглобулинов. Эксперименты с трансфекцией, аналогичные описанным выше для молекул МНС пасса I, показывают, что антигенные детерминанты молекул класса II, узнаваемые Т-клетками, формируются совместно доменами α1 и β1.

Таким образом, гликопротеины МНС классов I и II во многом поразительно сходны. У тех и других имеются четыре внеклеточных домена, из которых три содержат внутрицепочечные дисульфидные связи. Два ближайших к мембране домена подобны иммуноглобулиновым. Другие два домена взаимодействуют, образуя сложную трехмерную поверхность; в дальнейшем мы увидим, что эта поверхность, по-видимому, связывает чужеродный антиген и представляет его Т-клеткам. Все цепи, за исключением β2-микроглобулина, гликозилированы (на схеме не показано).

Каждый ген молекулы МНС класса I кодирует одну трансмембранную полипептидную цепь (обозначаемую α), большая часть которой свернута в три внеклеточных глобулярных домена (α1, α2, α3). Каждая α-цепь нековалентно ассоциирована с небольшим внеклеточным негликолизированным белком - β2-микроглобулином, который не связан непосредственно с мембраной и кодируется отдельным геном, находящимся

вдругой хромосоме (рис. 18-49, А). Как β2-микроглобулин, так и домен α3, расположенные ближе к мембране, гомологичны отдельному домену иммуноглобулинов. Два N-концевых домена α-цепи, наиболее удаленные от мембраны, содержат полиморфные (вариабельные) остатки, которые узнаются Т-клетками при трансплантационных реакциях.

Молекулы МНС класса II тоже представляют собой гетеродимеры с двумя консервативными иммуноглобулиноподобными доменами вблизи мембраны и двумя полиморфными (вариабельными) N-концевыми доменами, расположенными дальше от мембраны. Однако в этих молекулах обе цепи кодируются в пределах МНС и обе проходят насквозь через мембрану (рис. 18-49, Б). Наличие Ig-подобных доменов в гликопротеинах классов I и II позволяет предположить, что молекулы МНС и антитела имеют общую эволюционную историю (разд. 18.6.20).

Есть веские данные в пользу того, что полиморфные области молекул МНС обоих классов взаимодействуют с чужеродным антигеном и что именно комплекс молекул МНС с чужеродным антигеном узнается Т-клеточным рецептором. Однако прежде чем обсуждать эти данные, мы рассмотрим ту различную роль, которую играют молекулы класса I и класса II, направляя цитотоксические Т-лимфоциты и Т-хелперы к соответствующим клеткам-мишеням.

Главное функциональное различие между молекулами МНС класса I и класса II находит отражение в их распределении по тканям. Молекулы МНС класса I экспрессируются практически на всех клетках, содержащих ядро, тогда как распространение молекул класса II ограничено

восновном клетками, участвующими в иммунных ответах.

268

Рис. 18-51. Классический эксперимент, который показал, что цитотоксическая Т-клетка помимо вирусного антигена узнаёт и какой-то компонент поверхности клетки, инфицированной вирусом. Путем повторения этого опыта с клетками-мишенями, отличающимися от клеток инфицированной мыши только по ограниченным участкам генома, было показано, что компонент клеточной поверхности, узнаваемый цитотоксической Т-клеткой, представляет собой гликопротеин МНС класса I. Убивающую способность активных цитотоксических Т-клеток удобнее всего оценивать, используя радиоактивный изотоп 51Сг, который поглощается живыми клетками и освобождается только после их гибели. Поэтому стандартный метод оценки

активности цитотоксических Т-клеток включает их инкубацию в течение нескольких часов с клетками-мишенями, содержащими 51Сг, а затем измерение количества 51Сг, освобожденного из убитых клеток-мишеней.

Т-клетки узнают фрагменты внутренних вирусных белков. Вирусы - внутриклеточные паразиты, и их белки синтезируются путем экспрессии вирусных генов внутри инфицированной клетки (разд. 5.5). Поэтому можно предположить, что некоторые фрагменты образующихся вирусных белков «просачиваются» на поверхность зараженной клетки и связываются с молекулами МНС либо на поверхности, либо где-то внутри клетки

(рис. 18-52).

Такую точку зрения подкрепляют экспериментальные данные двоякого рода. Во-первых, если нормальные фибробласты в культуре на короткое время привести в соприкосновение с фрагментами внутреннего белка вируса гриппа (нуклеопротеина, НП на рис. 18-52), то эти клетки будут узнаваться и убиваться цитотоксическими Т-клетками, которые первоначально были активированы фибробластами, зараженными вирусом гриппа, но только в том случае, если те и другие фибробласты экспрессируют одни и те же гликопротеины МНС класса I. Во-вторых, если в нормальные фибробласты ввести последовательность ДНК, кодирующую фрагмент нуклеопротеина вируса гриппа, то трансфецированные клетки будут убиваться такими же цитотоксическими Т-клетками, как и в первом эксперименте. Эти и другие эксперименты позволяют

Таблица 18-2. Свойства молекул МНС класса 1 и класса II

269

Рис. 18-52. Цитотоксическая Т-клетка убивает клетку, инфицированную вирусом, в том случае, если она узнает фрагменты вирусных белков, связанные с молекулами МНС класса I на поверхности зараженной клетки. В представленном на схеме случае пептидные фрагменты образуются из нуклеопротеина (НП) вируса гриппа; для простоты показан только этот внутренний вирусный белок. Разрушается лишь очень малая доля вирусных белков, синтезируемых в клетке-мишени. Как происходит их расщепление и как образующиеся пептидные фрагменты достигают поверхности клетки, не известно; неясно также, где эти фрагменты первоначально ассоциируются с гликопротеинами МНС.

предполагать, что фрагменты вирусных белков могут попадать на поверхность клетки и связываться там с молекулами МНС класса I.

Нетрудно себе представить, как может происходить расщепление вирусных белков в инфицированных клетках, так как известно, что почти все клеточные белки непрерывно разрушаются (разд. 8.2.4). Труднее понять, как фрагменты вирусного нуклеопротеина попадают на поверхность клетки, поскольку вирусные белки синтезируются на цитоплазматических рибосомах и в обычных условиях не имеют доступа к полости эндоплазматического ретикулума, где обычно начинают свой путь белки, предназначенные для клеточной поверхности (разд. 8.1.4). Однако для узнавания Т-клетками требуются, вероятно, очень небольшие количества антигена. Поэтому случайный выход даже небольшой доли фрагментов нуклеопротеина на клеточную поверхность может привести к образованию клетки-мишени, которую мог бы узнать цитотоксический Т- лимфоцит.

18.6.9. Рентгеноструктурный анализ позволяет выявить антиген-связывающий участок гликопротеина МНС класса I [40]

Понимание того, каким образом молекулы МНС представляют антиген Т-клеткам, сильно продвинулось в 1987 г., когда методом рентгеноструктурного анализа была изучена трехмерная структура гликопротеина МНС класса I человека. Как показано на рис. 18-53, А, этот белок имеет единственный предполагаемый антиген-связывающий участок, находящийся на одном из концов молекулы. Он состоит из глубокой бороздки между двумя длинными α-спиралями, принадлежащими доменам α1 и α2; основание бороздки образуют восемь тяжей β-структуры в составе тех же доменов. Размеры бороздки - примерно 2,5 нм в ширину и 10 нм в длину. Этого достаточно для того, чтобы разместить пептид из 10-20 аминокислотных остатков в зависимости от того, насколько плотно уложена его цепь путем сворачивания или изгибания. Интересно, что в кристаллизованном белке бороздка не была пустой: она содержала небольшую молекулу неизвестного происхождения. Предполагают, что это пептид, который очищается и кристаллизуется вместе с гликопротеином МНС (рис. 18-53, Б). Эти данные заставляют заподозрить

270

Рис. 18-53. А. Структура гликопротеина МНС класса I человека, основанная на данных рентгеноструктурного анализа кристаллов внеклеточной части молекулы. Путем расщепления протеолитическим ферментом папаином внеклеточная часть молекулы была отделена от трансмембранного сегмента. Оба домена, расположенные ближе всего к плазматической мембране (α3- и β2-микроглобулины), сходны с типичным доменом иммуноглобулинов (см. рис. 10-28, Б). Два домена, наиболее удаленные от мембраны (α1 и α2), очень сходны между собой и образуют в верхней части молекулы бороздку -- предполагаемый антиген-связывающий участок. Полагают, что молекулы МНС класса II имеют весьма сходную структуру. Б. Вид сверху на предполагаемую антиген-связывающую бороздку, содержащую небольшую молекулу (вероятно, пептид), которая очищалась вместе с белком МНС. Именно эта часть молекулы МНС взаимодействует с Т-клеточным рецептором. (По P. J. Biorkman et al., Nature,

329, 506-512, 1987.)

в бороздке антиген-связывающий участок и указывают на то, что пептид, будучи однажды связан с этим участком, диссоциирует очень медленно. В пользу этого говорит и то, что фибробласты, короткое время соприкасавшиеся с фрагментами нуклеопротеина вируса гриппа, не менее трех дней остаются мишенями для цитотоксических Т-клеток, специфичных в отношении этого вируса.

Полиморфные аминокислотные остатки гликопротеина МНС (т. е. те остатки, которые варьируют в зависимости от аллельной формы молекул этого типа) локализованы большей частью либо внутри бороздки, где они могли бы связывать антиген, либо на ее краях, где были бы доступны для узнавания рецепторами Т-клеток. Полагают, что вариабельность молекул МНС класса I-результат отбора, приведшего к тому, что у них появилась способность связывать и представлять множество различных пептидов вирусного происхождения. Тем не менее продолжает удивлять то, что малое число различных антиген-связыва-