Инструкция по определению гемоглобина крови гемоглобинцианидным методом.

Принцип метода: гемоглобин при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин – гемиглобин, образующий с ацетонциангидрином окрашенный гемиглобинцианид, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству гемоглобина.

Оборудование: ФЭК, гемоглобинометр или спектрофотометр.

Посуда: пипетки на 0,02 мл и 5,0 мл, пробирки, колба мерная на 1 л.

Реактивы:

1. Ацетонциангидрин (2 флакона по 0,5 мл – 0,47 г).

2. Калий железосинеродистый (2 флакона по 200 мг).

3. Натрий двууглекислый (2 флакона по 1 г).

4. Стандартный раствор гемиглобинцианида.

Концентрация гемиглобинцианида в стандартом растворе производства фирмы "Реанал" (Венгрия) – 59,75 мг%, что соответствует при разведении крови в 251 раз концентрации гемоглобина – 15 мг%. Этот стандартный раствор хранят в холодильнике при 4⁰ С в защищенном от света месте (предохранять от замораживания).

Приготовление реактивов. Общее количество реактивов рассчитано на приготовление 2 л трансформирующего раствора (400 анализов). используя половину набора (по 1 флакону каждого реактива), можно приготовить 1 л трансформирующего раствора (200 анализов).

1. Трансформирующий раствор: содержимое трех флаконов 1,2 и 3 количественно переносят в мерную колбу и доводят дистиллированной водой до 1 л. Раствор стабилен при хранении в посуде из темного стекла при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. При появлении осадка или при обесцвечивании раствор не пригоден для употребления.

2. Стандартный раствор гемиглобинцианида применяется в неразбавленном виде.

Ход определения. 0,02 мл крови приливают к 5 мл трансформирующего раствора в пробирке (разведение в 251 раз) и хорошо перемешивают. Через 10 мин измеряют на ФЭКе при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против холостой пробы (трансформирующего раствора), на спектрофотометре при длине волны 540 нм или на гемоглобинометре. Стандартный раствор измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу.

Расчет содержания производят по формуле или по калибровочному графику:

Hb (%)=	Е оп	х С х К х 0,001
	Е ст

где: Е оп – экстинкция опытной пробы

Е ст – экстинкция стандартной пробы

С – концентрация гемоглобина в стандартном растворе – 59,75 мг %

К – коэффициент разведения крови

0,001 – коэффициент для перечета количества гемоглобина

из мг% в г%

Приложение № 2.

Нормальные показатели клинического анализа крови.

Показатель	Единицы СИ
	Показатель	Размерность
Гемоглобин М Ж	130,0-160,0 120,0-140,0	г/л
Эритроциты М Ж	4,0-5,0 3,9-4,7	х 1012/л
Цветовой показатель	0,85-1,05
Среднее содержание гемоглобина в 1 эритроците	30-35	пг
Ретикулоциты	2-10	‰
Тромбоциты	180,0-320,0	х 109/л
Лейкоциты	4,0-9,0	х 109/л

Нейтрофилы:
Миелоциты	- -	‰ х 109/л
Метамиелоциты	- -	‰ х 109/л
Палочкоядерные	1-6 0,040-0,300	‰ х 109/л
Сегментоядерные	47-72 2,000-5,500	‰ х 109/л

Эозинофилы	0,5-5 0,020-0,300	‰ х 109/л
Базофилы	0-1 0-0,065	‰ х 109/л
Лимфоциты	19-37 1,200-3,000	‰ х 109/л
Моноциты	3-11 0,090-0,600	‰ х 109/л
Плазматические клетки	- -	‰ х 109/л
Скорость (реакция) М оседания эритроцитов Ж	2-10 2-14	мм/ч

Приложение № 3.