Лабораторная работа 3 исследование продуктов гидролиза белков под действием протеолитических ферментов

Цель работы: Освоить метод определения активности протеолетических ферментов.

Общие сведения

Протеолитические ферменты катализируют расщепление белковых веществ до пептидов и дальнейший гидролиз этих продуктов до аминокислот. Распад белков и продуктов их гидролиза происходит по месту пептидных связей по следующей схеме:

где R| и R₂ - остатки аминокислот или пептидов.

Протеазы делятся на две группы - протеиназы иг пептидазы.

Пептидазы обладают очень большой специфичностью действия и делятся на три группы: аминопептидазы, карбоксипептидазы и дн-- пептидазы. Аминопеотадазы катализируют расщепление полипептидов по месту пептидной связи, расположенной у того конца пептида, на котором имеется свободная аминная груша:

где R₁, R_2, R₃ - остатки аминокислот; стрелкой показано место действия аминопептидазы.

Карбоксипетидаза расщепляет в полипептидах пептидную связь у того конца пептида, где имеется свободная карбоксильная группа:

где R_1, R₂, R₃ ~ остатки аминокислот; .стрелкой показано действие . карбоксипептидазы.

Во всех продуктах растительного происхождения протеиназы и пептидазы присутствуют вместе, поэтому гидролиз белков происходит до конца (до аминокислот).

Принцип метода: Определить активность протеолитических ферментов можно следующими способами;

1. автолизом, когда навеску исследуемого материала заливают водой, прибавляют антисептик (например, тимол или толуол) и под влиянием ферментов, находящихся в клетках этого же растительного материала, собственный белок расщепляется;

2. действием вытяжки фермента на препарат белка или какой-либо другой субстрат;

3) выделением ферментов из растительных тканей, очисткой этих ферментов и определением их действия на белки или препараты растительных тканей. Чаще всего активность протеолитических ферментов определяют более простым первым методом.

Активность протеаз учитывают обычно по количеству освобождающихся аминных или карбоксильных групп в навеске материала за определенный отрезок времени. Определение аминных групп можно проводить метопом Ван-Сляйка или методом Несслера.

Приборы к реактивы: колбы конические на 100 мл, колбы мерные на 100 мл; фосфатный буфер 1/15 М с рН 5,6 (0,5 мл 1/15 М Nа₂НРО₄ и 9,5 мл 1/15 М КН₂Р0₄); толуол; реактив Несслера (растворяют 2⁵ г йодистого калия в 50 мл воды, прибавляют 35 г йодистой ртути красной и в фарфоровой ступке пестиком растираю до полного растворения). Прибавляют 870 мл 15%-ного раствора КОН перемешивают, дают отстояться и декантируют прозрачную жидкость. Раствор хранят в темной склянке); сегнетовая соль 25%-ная. образцовый раствор NH₄Cl (0,7405 г х.ч. перекристаллизованного хлорида аммония растворяют в дистиллированной безаммиачной воде и доводят объем до 1 л, 20 мл этого раствора переносят в мерную колбу на 1 л, доводят объем до метки, 1 мл этого раствора содержит 0,005 мг NH₄.

Методика выполнения работы: Навеску 10 г муки помещают; г в коническую колбу емкостью 100 мл, приливают 50 мл дистиллированной воды, 20 мл фосфатого буфера (рН 5,6), 0,5 мл толуола,

При изучении активности ферментов в зависимости от температуры колбы с буфером выдерживают при различных температурах (3-8^о; 16-24^о; 35^о; 50^о) в течение 24 часов.

Обязательно ставят контрольную колбу с инактивированными ферментами. Инактивацию проводят кипячением содержимого колбы в течение 3--5 минут.

После соответствующей экспозиции колбы вынимают из термостата, фильтруют в мерную колбу на 100 мл, доводят до метки водой и 10 мл раствора используют для определения аминного азота методом Hесслера, после этого доводят объем до метки Периодическое разбавление опытного раствора при добавлении реактива Несслера обеспечивает получение прозрачного раствора чисто-желтого цвета.

Содержание в растворе аммония устанавливают по калибровочной кривой образцовых растворов. Для построения ее готовят образцовые растворы одновременно с испытуемым раствором. В мерные колбы на 100 мл помещают 0,5; 1; 2; 4 мл рабочего образцового раствора хлористого аммония, добавляют воды до половины объема, а затем раствор сегнетовой соли и реактив Несслера.

Просмотр окраски образцового и испытуемого растворов проводят через 10 минут после прибавления реактива Несслера при длине волны λ= 400 нм.

Содержание аммонийного азота (%) рассчитывают ко формуле

где а - количество азота по графику, мг,

в - общий объем раствора, мл (500),

с - объем раствора, взятый для окрашивания, мл;

а - навеска воздушно-сухого материала, г;

1000 - перевод мг в г.

Оформление работы

Образец	Температура воздействия, оС	Показания прибора	Количество азота по графику	Содержание азота, %
Контрольный
Опытный

Контрольные вопрсы

1. Дайте классификацию ггротеолетических ферментов.

2. Что является субстратом для действия протеаз?

3. Каковы продукты гидролиза белков?

4. В чем заключается значение протеаз в хлебопечении?

5. Какие вам известны ферментные препараты протеолитического действия?

6. Какова сущность метода определения активности протеолитических ферментов?

Рекомендуемая литература

[7] с 118-123, [11] с. 99-133, [13] с. 1S6-P7