III. Индикаторные или клеточные ферменты.

Это очень важная группа ферментов. Они все внутриклеточные, т.е. синтезируются и работают внутри клеток. В норме их активность в кро­ви низкая. В норме они попадают в кровь только благодаря обычному физиологическому распаду устаревших, износившихся клеток организма. При повреждении же клеток, например, при их некрозе, клеточные фер­менты через разрушенную плазматическую мембрану клетки будут попа­дать в кровь в больших количествах, активность ферментов будет резко возрастать.

То же будет наблюдаться и без разрушения клеток, но при повыше­нии проницаемости клеточных мембран, вызванном различными болезнен­ными состояниями, например, при резком нарушении энергетического об­мена (снижение внутриклеточного содержания АТФ при гипоксии), при воспалительных изменениях, при активации перекисного окисления липи­дов в мембранах и др. Отсюда ясно, что исследование активности кле­точных ферментов в крови представляет очень большую ценность, т.к. ферменты могут попадать в кровь даже раньше разрушения соответствую­щих клеток. Особенно важно в этих целях исследовать активность орга­носпецифичных ферментов, а также изоферментные спектры.

Что касается органоспецифичных ферментов, то в настоящее время их известно немало. Разберем некоторые из них.

Щелочная фосфатаза. Ее определение в плазме имеет очень большое значение в микропедиатрии. Повышение уровня ЩФ в плазме (сыворотке) крови оказалось одним из важных изменений химизма крови при рахите. Фосфатазами называют ферменты, которые отщепляют неорганические фос­фаты от органических фосфорных эфиров. В зависимости от оптимума рН, различают ЩФ (рН 8,6-9,4) и КФ (рН 3,4-6,2).

ЩФ сыворотки крови происходит из остеобластов костной ткани, кро­ме того, этого фермента много в стенках желчных протоков печени.

КФ происходит- из простаты, печени, селезенки, почек и эритроци­тов.

Клиническое значение: У детей грудного возраста увеличение ЩФ в

крови указывает на рахит. Чем выше активность ЩФ, тем тяжелее рахит.

Значительное увеличение ЩФ в крови наблюдается при застое желчи, связанном с закупоркой желчных протоков, например, камнями желчного пузыря или опухолью.

Важное диагностическое значение имеет определение ЩФ в лейкоци­тах крови. В основном ЩФ сосредоточена в нейтрофильных лейкоцитах. Повышение активности наблюдается при синдроме Дауна и, по-видимому, связано с нарушениями в 21-й хромосоме.

Понижение ЩФ в сыворотке крови может указывать на недостаточ­ность функции щитовидной железы (гипотиреоз) или - на некоторые ге­матологические заболевания.

Определение активности КФ применяется в основном при ранней ди­агностике и для наблюдения за ходом лечения карциномы предстательной железы.

Фосфатазы катализируют гидролитическое расщепление органических эфиров фосфорной кислоты. Они играют важную роль в минерализации тканей зуба, а также в течении физиологических процессов в тканях полости рта. Больше всего фосфатаз ротовой жидкости происходит из больших слюнных желез. Но они также могут выделяться из молочно-кис­лых бактерий, стрептококков и актиномицет. При заболевании пародонта в крови увеличивается активность фосфатаз как кислых, так и щелоч­ных.

Трансаминазы. Эти ферменты катализируют перенос аминогруппы от какой-либо аминокислоты к кетокислоте. В клинической практике наибо­лее широкое применение нашло определение двух трансаминаз - аспарта­таминотрансферазы (АсТ) и аланинаминотрансферазы (АлТ).

Аспартатаминотрансфераза (Аспартаттрансаминаза) обратимо ката­лизирует следующую реакцию:

СООН COOH СООН COOH

СН₂ (CH₂)₂ (СН₂)₂ CH₂

_{СНNH2 + C=O ==== СНNH2 + C=O}

COOH COOH COOH COOH

L-Аспартат альфа-Кетоглютарат L-глутамат ЩУК

АсТ широко распространена в тканях человека, из которых наиболее богатыми являются сердце, печень, скелетные мышцы и почки.

При ОИМ уровень фермента в сыворотке нарастает примерно в 4-5 раз, по сравнению с верхним пределом нормы, и остается повышенным 3 -5 дней. При стенокардии АсТ обычно не изменяется, что используют при дифференциальном диагнозе.

В случае заболевания печени наиболее высокие значения активности АсТ регистрируются при остром гепатите и других тяжелых изменениях клеток печени. Сывороточная активность в этих случаях может в 50 раз превышать верхний предел нормы. Этот тест полезен тем, что актив­ность трансаминаз при остром гепатите повышается прежде, чем появля­ется желтуха, что позволяет достаточно рано поставить диагноз. Осо­бое значение это имеет в детских коллективах (детских садах, яслях), когда можно рано выявить и изолировать всех заболевших инфекционным гепатитом.

Аланинаминотрансфераза (Аланинтрансаминаза) так же, как и АсТ, широко распространена в тканях человека, но самое большое количество его находится в печени. Следовательно, измерение активности этого фермента в сыворотке крови имеет большое диагностическое значение при заболеваниях печени.

АлТ обратимо катализирует следующую реакцию:

СН₃ COOH СН₃ СООН

СНNH₂ + (СН₂)₂ ==== С=О + (СН)₂

_{COOH С=О СООН СНNH2}

_{СООН COOH}

L-Аланин альфа-Кетоглютарат ПВК L-глутамат

Клиническое значение определяется тем, что сердечная мышца со­держит незначительное количество АлАТ, по сравнению с АсАТ, поэтому уровень АлТ в сыворотке крови при ОИМ остается в нормальных преде­лах, если только в результате застойных явлений вторично не затраги­вается печень.

При заболеваниях печени уровень АлТ так же, как и АсТ резко по­вышается, и даже в большей степени, чем АсТ.

Иногда используют так называемый индекс Де Ритиса, который обо­значает соотношение Аст/АлТ. Считается, что индекс Де Ритиса >1 ука­зывает на хронический, а <1 - на острый гепатит.

Следующий очень важный диагностический фермент - это орнитин­карбомоилтрансфераза. Это ключевой фермент цикла образования моче­вины. А поскольку этот цикл представлен только в печени, то повыше­ние его активности в сыворотке крови имеет исключительное диагнос­тическое значение при заболеваниях печени. Активность этого фермента также является очень чувствительным индикатором токсичности различ­ных веществ по отношению к печени, например, хлороформа, фенилбута­зона или избыточных количеств алкоголя.

Этими ферментами не ограничивается список диагностически важных ферментных показателей.

ИЗОЗИМЫ.

Ферменты могут находиться в виде множественных молекулярных форм (Vessel, Bearn, 1957) т.е. в виде изоферментов. Изоферменты - это ферменты, которые катализируют одну и ту же химическую реакцию, вы­рабатываются у одного и того же биологического вида, но отличаются по физико-химическим свойствам. Более 100 ферментов из известных в настоящее время встречаются в виде множественных молекулярных форм. Количество таких форм у каждого фермента может быть своим. Изофер­менты различаются по многим физико-химическим параметрам и обычно могут быть разделены с помощью стандартных методов белковой химии, например, с помощью электрофореза, хроматографии, гельфильтрации, ультрацентрифугирования и др.

Гетерогенность изоферментов достигается за счет наличия полипеп­тидных субъединиц. Так, например, ЛДГ у человека содержится в 5 раз­ных молекулярных формах: ЛДГ₁, ЛДГ₂, ЛДГ₃, ЛДГ₄, ЛДГ₅. Все они пост­роены из 2-х полипептидных цепей Н (heart) и M (muscel), имеют чет­вертичную структуру:

ЛДГ₁ ЛДГ₂ ЛДГ₃ ЛДГ₄ ЛДГ₅

_{НННН НННМ ННММ НМММ ММММ}

Каталитическая скорость каждой из форм ЛДГ - различна. Хотя по общему количеству ЛДГ разные органы и ткани практически не отличают­ся друг от друга, но изоферментный состав ЛДГ в разных тканях будет различаться довольно значительно. Так, 1-я и 2-я формы ЛДГ превали­руют в сердечной мышце, мозге, почках и эритроцитах. 4-я и 5-я формы в большем количестве содержатся в печени и скелетных мышцах. Отсюда, при наличии каких-то патологических изменений, например, при повреж­дениях некротического характера, в крови будет увеличиваться та мо­лекулярная форма, которая характерна для данного органа. Так, при инфаркте миокарда в крови повышается активность ЛДГ₁ и ЛДГ₂, а при остром гепатите - ЛДГ₄ и ЛДГ₅.

Другой характерный пример использования изоферментного спектра ферментов в диагностических целях, это электрофоретическое исследо­вание креатинкиназы. Этот фермент катализирует фосфорилирование кре­атина при помощи аденозинтрифосфата. Молекула фермента является ди­мером, состоит из В- или М-единиц. Так, креатинкиназа мозга состоит из двух В-единиц, скелетной мышцы - из 2 М-единиц, а креатинкиназа сердечной мышцы - из МВ-единиц.

Активность креатинкиназы повышается в 7-10 раз в первые же часы после острого инфаркта миокарда, что имеет огромное диагностическое значение. Но особенно важно, если обнаружено повышение активности изофермента креатинкиназы-МВ параллельно с повышением активности ЛДГ₁ и ЛДГ₂.

Обнаружение повышения активности диагностического фермента или его изоферментной формы имеет не только диагностическое, но и прог­ностическое значение. Так, если, например, при остром инфаркте мио­карда мы наблюдаем раннее, очень высокое по значениям и длительно сохраняющееся повышение активности КФК-МБ, ЛДГ₁ и ЛДГ₂, АЛТ и АСТ, то можно с уверенностью сказать, во-первых, об обширном инфаркте ми­окарда, а во-вторых, предсказать неблагоприятное течение с осложне­ниями и неясным прогнозом в смысле реабилитации.

ЭНЗИМОТЕРАПИЯ

Энзимотерапия включает в себя несколько важных разделов: I. Собственно энзимотерапия, т.е. применение с лечебной целью фермент­ных препаратов. II. Применение с лечебной целью антиферментных пре­паратов - различных ингибиторов и антиметаболитов. III. Применение с лечебной или профилактической целью коферментов или витаминов, из которых уже в самом организме образуются коферменты.

I. Применение ферментов с лечебной целью в свою очередь подразде­ляется на два вида: 1) применение в целях заместительной терапии и 2) с целью воздействия фермента на очаг заболевания.

С целью заместительной терапии наиболее широко используют пищева­рительные ферменты, когда у пациента обнаруживается их недостаточ­ность. В качестве примера можно привести препараты желудочного сока или чистый пепсин или ацидин-пепсин, который незаменим при гастритах с секреторной недостаточностью, при диспепсиях у детей. Панкреатин - препарат, представляющий смесь ферментов поджелудочной железы, приме­няют при панкреатитах, в основном хронического характера. Такое же значение имеют известные препараты холензим, панзинорм и др.

Другая область применения заместительной терапии - это лечение заболеваний, связанных с так называемыми энзимопатиями. Это заболе­вания врожденные или наследственные, при которых нарушен синтез ка­ких-либо ферментов. Эти заболевания обычно чрезвычайно тяжелые, дети с наследственным отсутствием какого-либо фермента живут недолго, страдают тяжелыми умственными и расстройствами, отсталостью физичес­кого и умственного развития. Заместительная терапия иногда может по­мочь преодолеть эти нарушения.

Целый ряд ферментных препаратов используют в хирургической прак­тике для очистки раневой поверхности от гноя, микробов, излишков грануляционной ткани; в клинике внутренних болезней их применяют:с целью разжижения вязких секретов, экссудатов, сгустков крови, напри­мер, при тяжелых воспалительных заболеваниях легких и бронхов. это в основном ферменты - гидролазы, способные расщеплять природные биопо­лимеры - белки, НК, полисахариды. В связи с их противовоспалительным действием их применяют также при тромбофлебитах, воспалительно-дист­рофических формах пародонтоза, остеомиелите, гайморите, отитах и др. воспалительных заболеваниях.

Среди них такие ферменты, как трипсин, химотрипсин, РНК-за, ДНК -аза, фибринолизин. Фибиринолизин также используют для удаления внутрисосудистых тромбов. РНК-азу и ДНК-азу с успехом применяют для лечения некоторых вирусных инфекций, например для уничтожения вируса герпеса.

Такие ферменты, как гиалуронидаза, коллагеназа, лидаза, исполь­зуются для борьбы с излишними рубцовыми образованиями.

Аспарагиназа - фермент, образуемый некоторыми штаммами кишечной палочки. Оказывает лечебный эффект при некоторых формах опухолей. Лечебный эффект связан со свойством фермента нарушать обмен амино­кислоты аспарагина, необходимой опухолевым клеткам для роста.

Применение ферментных препаратов с лечебной целью представляет пока еще очень молодое направление медицинской науки. Ограничением здесь является трудоемкость технологий и дороговизна получения чис­тых ферментных препаратов в кристаллическом виде, пригодном для хра­нения и применения у человека. Кроме того, при использовании фер­ментных препаратов приходится учитывать также и другие обстоятельст­ва:

1) Ферменты - это белки, а следовательно в некоторых случаях мо­гут вызвать нежелательную аллергическую реакцию.

2) Быстрым разложением введенных ферментов (белковый препарат, поэтому немедленно захватывается клетками "мусорщиками" - макрофага­ми, фибробластами и др. Отсюда, требуются большие концентрации пре­паратов, чтобы достичь нужного эффекта.

3) Однако при повышении концентрации ферментные препараты могут оказаться токсичными.

И все-таки, в тех случаях, когда удается преодолеть эти пре­пятствия, ферментные препараты оказывают прекрасный лечебный эффект.

Например, эти недостатки частично устраняются при переводе фер­ментов в так называемую "иммобилизованную" форму.

Более подробно о методах иммобилизации ферментов и способах их применения вы прочтете в ваших учебно-методических пособиях.