4.2. Ферменти протеолітичного комплексу

Протеолітичні ферменти належать до класу гідролаз, до четвертого підкласу пептидгідролаз. Це найбільш поширена група ферментів, що гідролізує пептидні зв’язки в білках і пептидах, а також діє на деякі інші зв’язки – ефірні, амідні.

Всі пептидгідролази за систематичною класифікацією поділяються на чотири підпідкласи (умовно – групи):

3.4.1 – -амінопептидаміноацидогідролази (амінопептидази);

3.4.2 – - карбоксіпептидаміноацидогідролази (карбооксіпептидази);

3.4.3 – діпептидгідролази (діпептидази);

3.4.4 – пептидпептидогідролази.

У першу групу (3.4.1) входять ферменти, які гідролізують N-кінцеві зв’язки в білках і пептидах; у другу (3.4.2) – ферменти, які гідролізують С-кінцеві зв’язки в білках і пептидах, тобто вказані групи пептидгідролаз є ферментами екзодії.

Третій підпідклас (3.4.3) розщеплює переважно внутрішні пептидні зв’язки білка і може бути віднесений до ендопептидгідролаз. Найчастіше пептидгідролази розглядають як комплекс протеолітичних ферментів або протеїназ без чіткого розподілу на зазначені систематичні групи.

Протеолітичні ферменти міцеліальних грибів і бактерій є комплексом протеїназ і пептидаз, специфічність якого залежить від продуцента і умов культивування.

Нині встановлено, що багато мікроорганізмів синтезують різні протеїнази, які діють у широкому інтервалі рН – від 1,8 до 10,5 й вище.

За характерним рН-оптимумом активності розрізняють три типи протеїназ: кислі (з оптимумом рН 2,5 – 3,0), нейтральні (оптимум рН 6,0 – 7,5) і лужні (оптимум рН 8,0 – 11).

Визначення протеолітичної активності (ПС) (модифікований метод Ансона)

Основою визначення протеолітичної активності є вимірювання кількості тирозину, який утворився в результаті ферментативного гідролізу білка, з реактивом Фоліна.

Після дії дослідного ферментного препарату на розчин казеїну білок, що не розклався, осаджують 5%-ю трихлороцтовою кислотою (ТХО) і у фільтраті за допомогою колориметричної реакції з реактивом Фоліна визначають кількість гідролізованого білка, який не осаджується ТХО. Беруть кількість розщепленого білка, пропорційну кількості тирозину, що міститься у фільтраті.

Одержані значення оптичної густини переводять у мікромолі тирозину за стандартною кривою, побудованою за чистим тирозином. За одиницю ПС взято таку кількість ферменту, яка каталізує перехід у неосаджуваний ТХО стан кількість білка, яка містить 1 мікромоль тирозину, за 1 хв при температурі 30 ^оС.

Протеолітичну активність препаратів виражають числом одиниць в 1 г препарату, а розчинів ферментів числом одиниць в 1 мл розчину.

Техніка визначення

Для визначення протеолітичної активності у дві пробірки наливають по 2 мл розчину казеїну і вміщують в ультратермостат з температурою 30 ^оС. Приблизно через 10 хв, після нагрівання розчину, у кожну з них додають по 2 мл розчину ферменту, струшують і поміщують в ультратермостат для гідролізу на 10 хв. Через 10 хв у обидві пробірки додають по 4 мл 5% ТХО, щоб перервати ферментативну реакцію і осадити білки та високомолекулярні продукти гідролізу. Суміш швидко перемішують і для забезпечення повного осадження витримують при температурі 30 ^оС ще 20 хв. Потім фільтрують через паперовий фільтр на маленьких воронках у сухі пробірки. Із прозорих фільтратів відбирають у пробірки по 1 мл, додають по 5 мл 0,5 М розчину Na₂CO₃, перемішують і при безперервному перемішуванні швидко додають по 1 мл робочого розчину реактиву Фоліна. Дають реакційній суміші постояти 20 хв. Розчини набувають блакитного забарвлення, інтенсивність якого визначають на фотоелектроколориметрі.

Контроль готують, додаючи реагенти у зворотному порядку: до 2 мл ферментного розчину того самого розведення, що і в досліді, додають 4 мл ТХО, витримують в ультратермостаті 10хв, а потім вносять 2 мл субстрату.

Через 20 хв витримування в термостаті розчин фільтрують, відбирають у суху пробірку 1 мл фільтрату, а потім при перемішуванні вносять 5 мл 0,5 М Na₂CO₃ та 1 мл робочого розчину реактиву Фоліна. Контрольна проба повинна мати слабке блакитне забарвлення.

Колориметрування здійснюють на ФЕК з червоним світлофільтром (довжина хвилі 670 нм) в кюветах завтовшки 10 мм. Спочатку визначають поглинання контролю проти води D_k, а потім поглинання дослідного розчину проти води D₀. Дійсне поглинання розчину становить D₀ – D_k. Для забезпечення достоменності аналізу поглинання розчину має бути в межах 0,3...0,6. У розрахунках використовують середнє значення, одержане із двох паралельних визначень.

Побудова калібрувальної кривої.

Для розрахунку активності необхідно побудувати калібрувальну криву по тирозину і обчислити за нею тирозиновий еквівалент, тобто ту оптичну густину, яку дав би 1 мкМ тирозину в 1 мл. Тирозиновий еквівалент використовується для обчислення протеолітичної активності.

Для побудови калібрувальної кривої готують розчин тирозину з концентрацією 10^-3 М. Для цього наважку 182,19 мг чистого тирозину розчиняють в 1 л 0,2 н. HCl. Із цього вихідного розчину готують подальші розведення, при цьому беруть 1, 2, 3, 4, 5 мл вихідного розчину у мірну колбочку місткістю 50 мл і доводять до мітки 0,2 н. HCl. Тоді виготовлені розчини будуть мати відповідно 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1 мкМ тирозину в 1 мл.

Потім у пробірку вносять по 1 мл стандартних розчинів, додають при перемішуванні по 5 мл 0,5 М Na₂CO₃ і 1 мл робочого розчину Фоліна. Глухий дослід готують так само, але замість розчину тирозину беруть 1 мл дистильованої води. Через 20 хв після додавання реактивів інтенсивність утвореного забарвлення вимірюють на фотоелектроколориметрі. Вимірювання проводять проти глухого досліду з червоним світлофільтром у кюветах з завтовшки 10 мм. Для більшої точності рекомендується приготувати три наважки тирозину і провести описаним вище методом три паралельних досліди. За одержаними даними будують калібрувальний графік, відкладаючи на осі абсцис кількість тирозину, а на осі ординат – відповідні значення оптичної густини (рисунок).

Рис.4.1 . Залежність оптичної густини від концентрації тирозину

На основі калібрувального графіка виводять тирозиновий еквівалент (ТЕ). ТЕ – оптична густина розчину тирозину, який містить 1 мкМ тирозину в 1 мл. На наведеній кривій 0,1 мкМ тирозину дає оптичну густину 0,151, тоді 1 мкМ повинен дати 1,51. Значить ТЕ дорівнює 1,51.

Розрахунок активності. Протеолітичну активність од./г, визначають за формулою

ПС=, од/г

де D = D₀ – D_K – оптична густина; 4 – об’єм реакційної суміші, мл; 10 - час гідролізу, хв ; n – кількість ферментного препарату, яку взято на протеоліз, мг у 1 мл ферментного розчину; 1000 – переведення одержаних одиниць на 1 г ферментного препарату.

Для визначення протеолітичної активності розчину (наприклад, культуральної рідини), од / мл, користуються формулою,

ПС =

де n - кількість розчину, взятого на аналіз, мл; Р – розведення досліджуваного розчину.

Реактиви. Розчин субстрату – 2%-й розчин казеїну. Для його приготування 2,0 г повітряно-сухого казеїну (вологість 8 – 10 %) заливають 100 мл 1/15 М фосфатного буферу рН 8,0 і нагрівають до повного розчинення осаду на водяній бані, перемішуючи скляною паличкою. Після охолодження розчину перевіряють рН потенціометрично і у разі необхідності доводять до значення 8,0 додаванням 1 н. NaOH або 1 н. HCl. Розчин можна зберігати у холодильнику не більше трьох діб .

2%-й розчин гемоглобіну (субстрат). Для його приготування наважку 2 г повітряно-сухого гемоглобіну розтирають у ступці з невеликою кількістю дистильованої води, переносять кількісно у мірну колбу на 100 мл, підкислюють 0,3 н. HCl до рН 3,0 і об’єм доводять до мітки дистильованою водою. Розчин необхідно готовити щодня, бо він нестійкий.

0,3 М розчин трихлороцтової кислоти. Для його приготування беруть наважку 50 г ТХО беруть на технічних терезах, переносять у колбу на 1 л і доводять до мітки дистильованою водою, після чого фільтрують .

Визначення активності лужної протеази ( метод ФОЛП)

Метод розроблено на основі методу Ансона спеціально для визначення активності лужних протеаз.

За одиницю протеолітичної активності взято таку кількість ферменту, яка каталізує гідроліз 1 г білка (казеїну) в строго визначених умовах – рН 10,5 і при температурі 40 ^оС, тривалість гідролізу 1 год.

Метод базується на визначенні тирозину, що утворюється в результаті гідролізу білка, з реактивом Фоліна, як і метод Ансона.