biotechnologie

которых можно с успехом выращивать протопласты и получать из них целые растения, что указывает на тотипотентность многих протопластов.

Слияние протопластов

Изолированные протопласты за тот короткий промежуток времени, пока они не образуют клеточную стенку, могут сливаться друг с другом. Такое слияние может быть спонтанным и происходит чаще, если используются протопласты, полученные из молодых тканей или из суспензионных культур клеток. Однако этот процесс может быть стимулирован путем добавления определенных веществ, что позволяет осуществить слияние не только протопластов одного вида, но и гетерологичных. Таким способом удалось даже получить регенерированное растение после слияния протопластов растения табака двух видов.

Довольно эффективным индуцирующим слиянием протопластов агентом оказался полиэтилен гликоль (ПЭГ), обеспечивающий сильную адгезию протопластов. С его помощью были получены гибриды протопластов растений и животных клеток, протопласты растений и водорослей. Недостатком данной техники является то, что с ее помощью не удается получить большое количество слившихся протопластов за один прием. Методы слияния протопластов довольно существенно различаются, но конечный результат их одинаков, вплоть до слияния с помощью индукции электрическими импульсами. При всех методах на первом этапе происходит агрегация протопластов вследствие, как полагают, изменений их поверхностного потенциала. Последующее воздействие индукторов слияния сводится к определенным изменениям структуры мембран, увеличивающим их текучесть. Электронномикроскопическое исследование с использованием метода замораживания–травления свидетельствует о том, что слияние мембран осуществляется в местах, свободных от внутримембранных образований (частиц). Такие участки имеют липидную природу и возникают, повидимому, в результате фазового разделения.

Слияние, индуцируемое электрическими импульсами, возникает, вероятнее всего, в результате диэлектрического разрушения соприкасающихся мембран протопластов. Вокруг возникающей "дырки"возможен обмен молекулами липидов с образованием липидных мостиков, что в конечном счете приводит к слиянию мембран, поскольку развивается энергетически более выгодное состояние, нежели наличие

101

двух поврежденных мембран. Процессы, сопровождающиеся обменом липидов, являются следствием особенностей жидкостно-мозаичной структуры клеточных мембран и могут быть связаны с их текучестью.

Гибридизация соматических клеток

Разработка методов индуцированного слияния протопластов, а также развитие техники культивировании растительных клеток in vitro, обеспечивающей возможность получения изолированных протопластов, их выращивания с образованием каллуса и в последующем целого растения, обеспечила формирование нового весьма перспективного метода гибридизации растений, получившего название соматической гибридизации. Сущность данного приема состоит в том, что в качестве гибридизуемых клеток используют не гаметы (репродукционные клетки), а клетки тела растений (соматические), из которых получаются протопласты. Слияние протопластов обеспечивает объединение не только клеточных геномов, но и двух различных цитоплазм. В большинстве описанных (известных) случаев слияние протопластов высших растений приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридное растение содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро – одного.

Важным моментом при индуцированном слиянии гетерологичных (неродственных) протопластов является наличие подходящего селективного маркера, позволяющего идентифицировать нужный продукт слияния, поскольку индуктор в своем воздействии неспецифичен и способствует агрегации и слиянию протопластов как одинаковых, так и гетерологичных видов. Одним из таких маркеров могут быть пластиды и, в частности, хлоропласты. Конечно, помимо пластид можно использовать (и, по-видимому, с не меньшим успехом) биохимические или генетические маркеры: например, изоэнзимный состав, особенности нуклеиновых кислот, устойчивость к определенным веществам, количество хромосом или кариотипы клеток.

Протопласты являются весьма лабильными образованиями и могут служить объектами для введения в клетку чужеродных материалов не только путем соматической гибридизации за счет слияния протопластов, но и посредством переноса в них изолированных ДНК или органелл других клеток. Удалось трансплантировать ядра, хлоропласты, что позволяет рассматривать данный прием в качестве достаточно перспективного для целей клеточной инженерии. Таким образом, в настоящее время уже существуют методы, позволяющие осуществлять

102

конструирование клеток растений с новыми свойствами с последующим получением из них не только клеточных систем, но и целых растений, соответствующих насущным потребностям человека.

103

Литература

Основная

1.Елинов Н. П. Основы биотехнологии. СПБ: Наука, 1995.

2.Бекер М. Е., Лиепиньш Г. К., Райнулис Е. П. Биотехнология. М.: Агропромиздат, 1990.

3.Серия «биотехнология»: в 8 кн. / Под ред. Н. С. Егорова и В. Д. Самуилова. М:

Высш. Шк., 1987–1988.

4.Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. М.: Мир, 1987.

5.Сельскохозяйственная биотехнология: векторные системы молекулярного клонирования. М.: Агропромиздат, 1991.

6.Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. М.: Мир, 2002.

Дополнительная

1.Сб. «Биотехнология» / Под ред. А. А. Баева М.: Наука, 1984.

2.Овчинников Ю. А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987.

3.Дебабов В. Г., Лившиц В. А. Современные методы создания штаммов промышленных микроорганизмов. 1987.

4.Бутенко Р. Г. и др. Клеточная инженерия. 1987.

5.Гриневич А. Г., Босенко А. М. Техническая микробиология. Мн.: Выш. шк. 1986.

6.Грачева И. М. Технология ферментных препаратов. М.: Агропромиздат, 1987.

7.Березин И. В. и др. Инженерная биотехнология. 1987.

8.Быков В. А. и др. Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов. 1987.

9.Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology // Ed. In chief A.L.Demain, J.E.Davies.-ASM.Washington, DC,. 1999.

104