ЛАБОРАТОРНЕ ЗАНЯТТЯ 1

ЗАГАЛЬНІ ПРАВИЛА РОБОТИ З БАКТЕРІЯМИ І БАКТЕРІОФАГАМИ Мета: засвоєння правил пересівання та зберігання бактерій і бактеріофагів;

ознайомлення та опанування методів визначення титру бактерії й бактеріофагів. Матеріали та обладнання: термостат; чашки Петрі з повним агаризованим

середовищем; пробірки з 4,5 мл фосфатного буфера ; пробірки з 4,5 мл розведеного 0,5 % NaCl бульйону Хоттингера; пробірки з 3 мл 0,7 % повного агаризованого середовища; стерильні піпетки ; шпателі Дригальського; суспензія культури Escherichia coli концентрацією 10⁹ клітин/мл; суспензія бактеріофага Т4В концентрацією 10⁹ частинок/мл.

Загальні відомості

Мікроорганізми активно використовують як об’єкти генетичних експериментів з 40-х років XX століття. Їхній вибір був зумовлений потребою вирішення важливих проблем, які з’явилися з розвитком генетики, насамперед дослідження природи гена як матеріальної структури живої клітини та його біохімічної функції, та визначив перехід до вивчення генетичних процесів на молекулярному рівні. Мікроорганізмам властиві певні особливості, що сприяють вирішенню таких проблем:

• їх можна культивувати у строго контрольованих умовах – у поживних середовищах відомого хімічного складу, при певній температурі, аерації тощо. Це означає, що дослідник може постійно контролювати вплив умов існування організму на функціонування генів;

• мікроорганізми мають короткий життєвий цикл. Наприклад, за оптимальних умов росту час генерації (період часу між двома послідовними поділами клітини) у кишкової палички Escherichia coli становить 20–30 хв. Отже, за невеликий проміжок часу можна отримати багато поколінь нащадків певного організму. Популяції нащадків одного організму можуть становити мільйони та мільярди особин. Це важливо, бо генетичні закономірності виявляються у ряді поколінь та мають статистичний характер. Це дає змогу виявляти рідкісні генетичні зміни, наприклад, виділяти мутанти, частота яких є дуже низькою (10^-6–10^-9), виявляти рекомбінанти, що виникли у результаті внутрішньо-генного кросинговеру тощо.

• більшості мікроорганізмів одна особина – це окрема клітина. У генетиці зазвичай вивчають не окремі особини, а клонові культури мікроорганізмів (клони). Клон – це культура, що виникла у результаті нестатевого розмноження клітини. У вірусів клони – це нащадки однієї вірусної частинки. Отже, клони є групами спадково однорідних особин. Найчастіше клони отримують після посіву суспензій клітин мікроорганізмів на твердих поживних середовищах.

Окремі клітини діляться, утворюючи колонії, що і є клонами. Клони вірусів виділяють із зон лізису (негативних колоній), які виникають після посіву суспензії вірусів на газон чутливих до них культур клітин. Кожна негативна колонія утворена нащадками однієї вірусної частинки.

11

Досліджують як індивідуальні ознаки клітин мікроорганізмів, наприклад, розмір та форму клітин, особливості будови і функції їхніх органел, так і ознаки клонів. Розмір, форма, характер поверхні та забарвлення колоній, здатність культури засвоювати певні речовини як джерела живлення, чи продукувати певні речовини – це ознаки клонів. Ознаки клонів насамперед визначаються властивостями клітин, які їх утворюють. Так, наприклад, гладенькі слизисті колонії виникають завдяки здатності клітин утворювати полісахаридну капсулу. З первинного клона можна отримати вторинні клони (субклони).

Клонові ознаки зазвичай зберігаються в абсолютної більшості вторинних клонів за незмінних умов росту та розмноження. Однак у клоні можуть виникати і нагромаджуватися мутанти з новими ознаками. Тому генетична однорідність клона є відносною й тимчасовою. Клонована культура, генетична однорідність якої підтримується селекцією за певними ознаками, називається штамом.

1.1. Escherichia coli

Кишкова паличка Escherichia coli є одним з основних об’єктів генетики, молекулярної біології та генетичної інженерії. Це грамнегативна бактерія, клітини якої мають паличкоподібну форму із злегка заокругленими кінцями. Розміри: 0,4– 0,8 в ширину та 1 –3 мкм в довжину. Не утворює спор. Оптимальні умови росту: температура 30–37°С, рН 7,2–7,5. Досить добре розмножується й при кімнатній температурі. Утворює опуклі напівпрозорі колонії сіруватого кольору. Гетеротроф, факультативний анаероб, зброджує глюкозу, лактозу, мальтозу, арабінозу, галактозу, ксилозу, рамнозу та інші цукри, утворює індол та сірководень, відновлює нітрати в нітрити. Є звичайним компонентом нормальної кишкової мікрофлори людини й багатьох хребетних та безхребетних тварин.

E. coli постійно виявляють й у зовнішньому середовищі – в ґрунті, воді, на різних предметах. Деякі штами E. coli є умовно-патогенними та патогенними.

Штам E. coli K-12 виділено в 1922 році в Стенфордському університеті США. Використовуючи даний штам як вихідний, було отримано більше 3000 штамів E. coli , які використовують у генетиці, молекулярній біології та біотехнології. У генетичних дослідженнях кишкову паличку вперше використали Дж. Бідл та Е. Т ейтум. Вони вивчали генетичний контроль метаболізму, використовуючи ауксотрофні мутанти E. coli. У 1946 Дж. Ледерберг та Е. Тейтум відкрили кон ’югаційний процес у кишкової палички, що стало поштовхом для опрацювання методів генетичного аналізу цієї та інших бактерій. Саме у дослідах на Е. соli були встановлені основні закономірності таких важливих процесів, як реплікація, рекомбінація та репарація ДНК, мутагенез, транскрипція та трансляція, розшифровано генетичний код та механізми регулювання активності генів, опрацьовано принципи і методи генетичної інженерії.

У 1997 році секвеновано геном штаму E. coli К-12. До 2005 року секвеновано також геноми ще трьох патогенних штамів E. coli: 0157:Н7, 0157:Н7 ЕDL933 та CFT073. У клітинах E. coli є одна хромосома, яка містить кільцеву дволанцюгову молекулу ДНК. Розміри цієї молекули в різних штамів E. coli коливаються від 4,6 до 5,6 млн п .н. У штаму E. coli К-12 у хромосомній ДНК 4639221 п.н. У ній ідентифіковано 4288 відкритих рамок зчитування, що кодують

12

відомі та ймовірні білки , 7 оперонів генів рРНК (16S, 23S та 5S) та 86 генів тРНК. Гени білків становлять 87% геному, гени стабільних РНК – 0,8%, некодуючі послідовності, що повторюються – 0,7%, решта (≈11%) послідовностей виконують регуляторні та інші функції. Середній розмір гену – 951 п.н.

Для штамів Е. сoli властиві такі способи генетичного обміну, як кон’югація та трансдукція. Розроблено методики отримання компетентних клітин Е. сoli та їхньої трансформації екзогенною ДНК. Саме штами E. coli найчастіше використовують як реципієнти для клонування ДНК у генно-інженерних дослідах. Ці штами несуть низку мутацій, які роблять їх хорошими реципієнтами ДНК, а також обмежують здатність розмножуватися в кишковому тракті та виживати у природному сенредовищі поза контрольованими умовами лабораторії.

У більшості бактеріологічних лабораторій організовані музеї живих культур мікроорганізмів, що використовуються в процесі навчання, в дослідницьких, промислових та інших цілях. Правильне зберігання культур є надзвичайно важливою проблемою, якій слід приділяти таку ж увагу, як і стандартизації обладнання та вибору хімічних речовин. Втрата або зміна властивостей основних культур внаслідок їх неправильного зберігання завадили б виконанню багатьох наукових програм.

Основними цілями зберігання є підтримка життєдіяльності клітин і чистоти культур , а також попередження змін і мутацій, тобто збереження мікроорганізмів в стані, максимально близькому до початково виділеного штаму. Існує багато методів зберігання бактерій, проте не всі штами при використанні якого-небудь з них ведуть себе однаково. Вибір методу часто визначається наявністю обладнання, місця для зберігання і кваліфікованих співробітників.