Тема 3. Активний, алостеричний центри ферментів. Регуляція активності ферментів. Активатори та інгібітори ферментів. 2 год

Лабораторна робота Визначення активності амілази слини та сечі в присутності активатора та інгібітора

Мета заняття:

Студент повинен знати:

• роль активного та алостеричного центрів у дії ферментів

• принципи регуляції активності ферментів

• механізм дії активаторів та інгібіторів на активність ферментів /на прикладі амілази слини/;

• діагностичне значення визначення активності амілази в сечі /при панкреатитах/.

Студент повинен вміти:

- визначити активність амілази /діастази/ в біологічних рідинах, /слини та сечі/ в присутності активаторів та інгібіторів;

- простежити та оцінити дію активаторів та інгібіторів амілази;

1. Матеріали методичного забезпечення теми

1. Завдання для перевірки вихідного рівня знань, вмінь

1. Від чого залежить швидкість хімічних реакцій

2. Фактори, які впливають на швидкість ферментативної реакції

3. Енергія активації хімічних реакцій

4. Механізм прискорення ферментами хімічних реакцій

5. Активатори ферментів

6. Інгібітори ферментів. Оборотне і необоротне інгібірування

7. Алостеричні центри ферментів

8. Природа алостеричних ефекторів

9. Шляхи визначення активності ферментів

10. Одиниці активності ферментів

11. Структура активного центру ферментів

12. Хімізм визначення активності амілази у біологічних рідинах

13. Написати формули глюкози, фруктози, галактози, мальтози, лактози, сахарози, целобіози, фрагменту глікогену.

1.2. Зміст лабораторної роботи

1. Визначення активності амілази слини в присутності активатора та інгібітора.

Принципи методу: Амілазну активність слини та сечі визначають кількостю субстрату (крохмалю), розщепленого 1мл слини чи сечі за вставлений про­міжок часу (30 хвилин), і ґрунтується на знаходженні максимального розчинення при якому досліджувана рідина, що розщеплює крохмаль до стадії червоного забарвлення з йодом (утворення еритродекстринів). Хлористий натрій прискорює розчеплення крохмалю під дією амілази. Сірчанокисла мідь сповільнює дію амілази. В нормі у сечі людини міститься мало амілази. Кількість амілази в сечі підвищується при панкреатитах, паротитах, орхітах.

Хід работи. а) Приготування ряду розведень слини. Приготуйте три ряди пробірок по 10 у кожному. До всіх пробірок налийте із бю­ретки по 1 мл дистильованої води. В пробірки під №1 до­дайте по 1 мл слини, розведе­ної у 10 разів. Перемішайте рідину. З отриманого розчину слини 1 мл пере­нести в пробірку №2. Перемішайте. Із пробірок під №2 перенесіть по 1 мл. рідини в пробірку під № 3 та ін. Із пробірок під № 10 по 1 мл рідини вилити. Одержали 3 ряди пробірок із розведеною слиною, в кожній наступній пробірці концентрація ферменту в 2 рази менша, ніж у попередній.

б) Добавлення активатору та інгібітору. Додайте у 10 пробірок І-го ряду 1 мл води. Цей ряд буде контролем, з ним порів­нюють активність амілази в присутності активатора та інгібітору. В ІІ-й ряд пробірок додати по 1 мл. 0,85% розчину NaCl, який є активатором амілази. В ІІІ-й ряд пробірок додати по 1 мл. розчину CuSO₄, яка інгібірує дію амілази.

в) Приготування фермент-субстратної суміші. Налити в усі пробірки по 2 мл розчину крохмалю та швид­ко перемішати. Починати з 10 пробірки, тобто з самого більшого розведення слини, де сама найменша концент­рація ферменту.

г) Інкубація. Помістити всі 30 пробірок на 30 хвилин на водяну баню при 37⁰С. Додати в кожну пробірку по 2 краплі йоду (розчину Люголя), перемішати і спостерігати гаму кольору від жовтого до синього. В пробірці, де рідина синього кольору, розчеплення крохмалю не відбулося. Достатнє розчеплення відбувається, наприклад, в пробірці №5, де слина розведена у 320 разів, тобто 1/320 мл слини розщеплює 2 мл 0,1% розчину крохмалю, а 1 мл неразведеної слини розщеплює – Х мл крохмалю. Це зображується так:

А (амілазна акт.)

2. Визначення амілазної активності сечі. а) Приготування ряду розведень сечі. Сеча значно бідніша на амілазну активність, ніж слина. У зв’язку з цим взяти декілька (5-6) пронумерованих пробі­рок, в кожну налити з бюрет­ки по 1 мл. 0,85% розчину хлористого натру, потім до­дати в першу пробірку 1 мл сечі, перемішати і 1 мл суміші перенести в пробірку №2 і т.д. З останньої пробірки 1 мл суміші вилити. Отримують розве­дення сечі в геометричній прогресії.

б) Приготування фермент-субстратної суміші. В кожну пробірку налити по 1 мл розчину крохмалю, перемішати, поставити на 15 хвилин на водяну баню при 45⁰С. Наступні операції та розрахунки ведуть як і при роботі з слинею. Сеча здорових людей містить у нормі Д – діастаза.

Медико-біологічна оцінка отриманих результатів

Висновки: 1. амілаза гідролізує 1,4-глікозидні зв’язки у крохмалі, утворюючі еритро- та ахродекстрини, які не дають з йодом синього забарвлення;

2. розчин NaCl є активатором амілази, розчин CuSO₄ – інгібітор амілази;

3. підвищення активності амілази у крові та сечі свідчить про запальні ураження залоз, що продукують амілазу (слинних, статевих, підшлункової)

3. Запитання для перевірки кінцевого рівня знань

1. Модифікація активності ферментів

2. Конкурентне та неконкурентне інгібірування

3. Хімічна природа алостеричних активаторів та інгібіторів

4. Роль циклічних нуклеотидів у регуляції активності ферментів

5. Ковалентна модифікація ферментів

6. Обмежений протеоліз проферментів

7. Ретроінгібірування у регуляції активності ферментів

1.4 Тестові завдання до теми (вибрати з тестових завдань до модульного контролю)

1.5 Теми для самостійної роботи студентів

1. Застосування активаторів ферментів у медицині

2. Застосування інгібіторів ферментів у медицині

Наступна тема №4. Коферменти, їх роль у каталізі. Коферментні функції

вітамінів 2 год

Тема №4. Коферменти, їх роль у каталізі. Коферментні функції вітамінів.

Лабораторна робота Дослідження ролі піридоксальфосфату у каталітичній активності амінотрансферази

Мета заняття:

Студент повинен знати:

- структуру складних ферментів, роль коферментів і апоферментів у каталізі

- групи коферментів і коферментні функції вітамінів

- відмінності між коферментами і простетичними групами

Студент повинен вміти:

- визначати активність складних ферментів і вплив коферментів на їх активність