7.5 Клонування і експресія генів в різних організмах

На даний час розроблені системи клонування в бактеріях, дріжджах, грибах, рослинах і ссавцях. Особливий інтерес з економічної точки зору представляють системи клонування генів в грампозитивних бактеріях, більшість з яких є зверхпродуцентами важливіших хімічних з’єднань. Значних успіхів в біоіндустрії вдалося досягти з клітинами Bacillus subtilis, стрептоміцетами і Saccaharomyces cerevisiae.

Вектори для клонування в таких системах являють собою подвійні реплікони, які здатні існувати і в E. сoli, і в тій клітині хазяїна, для якої вони призначені. З цією метою створюють гібридні вектори, що містять реплікон якоїсь із плазмід E. coli і потрібний реплікон ( із бактерій, дріжджів та ін.), і початково клонують з послідуючим відбором необхідних генів в добре вивченій системі. Потім виділені рекомбінантні плазміди вводять в новий організм. Такі вектори повинні містити ген (або гени), що надає клітині-хазяїну ознаку, яка легко тестується.

B. subtilis - непатогенний грунтовий мікроорганізм. Клітинна стінка бактерії має просту структуру, яка дозволяє секретувати більшість білків в культуральну рідину. Зокрема, 20 різних видів бактерій синтезують більш ніж 40 ферментів позаклітинною локалізацією. В цих бацилах виявлено плазміди і фаги, генетика яких добре вивчена. Клонування здійснюється за допомогою так званих човникових векторів, які здатні реплікуватися в клітинах декількох хазяїв: B.subtilis E.coli Staphylococcus aureus. Вектори були одержані комбінацією in vitro фрагментів плазмід St aueus, E. coli і хромосомних фрагментів B. subtilis. Отримані рекомбінантні штами несуть ознаки стійкості до антибіотиків.

Стрептоміцети широко застосовують в біотехнології в якості продуцентів антибіотиків. Конструювання векторів для клонування в них почалося з виділенням плазміди Scp 2 із Streptomyces coelicolor. На основі цієї плазміди були сконструйовані вектори, які придають стрептоміцетам стійкість до антибіотиків, наприклад до метиленоміцину А.

Клонування в дріжджах. Серед дріжджів найбільш повно вивчений вид S. cerevisiae . У цього виду в гаплоїдних клітинах міститься 17 хромосом, в їх складі ідентифіковано декілька сотень генів. Більшість штамів дріжджів містять кільцеву ДНК довжиною 2 мкм, що автономно реплікується. Плазміда Scp1 S. Cerevisiae містить близько 6300 пар основ і має 50-100 копій на клітину. Її гібриди з плазмідами зазвичай і використовують у якості векторів. Робота з дріжджами полегшується тим, що подібно бактеріям вони можуть рости в рідкому середовищі і давати колонії на твердому середовищі, а такі мають порівняно короткий час регенерації (декілька годин) в наслідок малого розміру геному.

Процедура виділення ДНК в клітині дріжджів досить проста. Зазвичай, целюлозну клітинну стінку видаляють обробкою ферментами, отримуючи так звані сферопласти. Їх інкубують з ДНК в присутності CaCl₂ і поліетиленгліколя. Мембрана при цьому стає проникною для ДНК. Подальша інкубація сферопластів в середовищі з агаром відновлює клітинну стінку. Селекція дріжджових клонів, трансформованих рекомбінантними плазмідами, заснована на застосуванні в якості клітин-хазяїв, визначених мутантів, які не здатні рости в середовищі, в якій відсутній той чи інший поживний компонент. Векторна плазміда містить гени, і при потраплянні в клітину-хазяїна надає їй ознаку, якої не вистачає. Трансформанти легко відбираються по їх здатності давати колонії на збіднілому середовищі. Застосовуючи заходи, аналогічні при клонуванні в бактеріях, вдається досягти синтез чужорідних білків у дріжджових клітинах. Ці клітини, подібні B. Subtilis, секретують велику кількість білку у позаклітинне середовище, що використовується також для секрецій чужорідних білків, наприклад інтерферона людини.

Клонування в клітинах тварин. Проблема введення генів у клітини ссавців дуже важлива для дослідження функціонування генів вищих еукаріот.

Заздалегідь клоновані гени вводять в клітину тварин різними шляхами. Суть одного з них полягає в трансформації клітин необхідним геном, з’єднаним з одним з генів, для яких здійснюється селекція. Для ідентифікації і послідуючого розмноження клітин, які містять інтегровану ДНК, був розроблений метод, який отримав назву методу маркера. Прикладом може слугувати метод отримання клітин, дефектних по синтезу ферменту тимідинкінази (ТК^-- клітини). Такі клітини трансформувалися фрагментами ДНК вірусу герпесу (HSV), що містить ген ферменту ТК, і після трансформації вони набували здатність до синтезу фермента на селективному середовищі, тобто ставали ТК⁺ - клітинами. Клітини ТК⁺ легко відрізняються від клітин ТК^-, оскільки здатні рости на середовищах з аміноптерином (інгібітор, що блокує певні стадії біосинтезу нуклеотидів), гіпоксантином та тимідином. Відповідно, в даному випадку для трансформації клітин тварин були використані гібриди бактеріальних плазмід з геном ТК із віруса герпеса. Для цього попередньо проводили клонування та ідентифікацію генів у клітинах Е.coli і потім отримана рекомбінантна плазміда вводилась в ТК^- - клітини. Аналіз методом блот-гібридизації підтвердив, що клітини, які вижили, містили інтегрований в геном ТК – ген віруса герпеса.

Селективні маркери дають можливість вводити в клітини ссавців будь-який ген, заздалегідь лигіруваний з клонованим селективним маркером.

В останні роки сконструйована велика кількість так званих човникових векторів і їх рекомбінантних похідних, здатних до реплікації в тваринній і бактеріальній клітинах, що експресують ген, який клонується, в тваринній клітині. До числа таких векторів можна віднести вектори із плазміди рВR 322 та інтактного району транскрипції ДНК SW-40. Геном SW-40 являє собою циклічну ДНК довжиною 5243п.о. Однак у вірусах тварин розміри несуттєвих областей малі і в них не можна впровадити великі фрагменти чужорідної ДНК, наприклад ген дигідрофолатредуктази миші величиною 42 kb. В більшості випадків чужорідна ДНК замінює суттєві гени, в результаті чого рекомбінантні віруси втрачають здатність до реплікації. Для їх функціонування використовують «віруси-помічники», які синтезують продукти недостаючих генів, за рахунок яких і існує рекомбінантний вірус. Зазвичай пухлинні віруси (в тому числі SV-40) впроваджують свою ДНК в хромосому клітини-хазяїна і тим самим убивають її при своєму розмноженні. Вірус бичачої папіломи в трансформованих клітинах існує у вигляді епісоми (≈ 100 копій на клітину) і використовується в якості основи для конструювання епісомних векторів. Одним із найважливіших завдань генної інженерії є розробка технологій по створенню векторів, подібних до плазмід, що не вбивають клітину-хазяїна і ефективно експресують клонований ген в тваринній клітині.

Важливий інтерес мають мікроін’єкції ДНК безпосередньо в ядро клітини. Так, плазміди, що утримують фрагмент вірусу герпеса з геном тимідинкінази, і плазміди pBR 322 були ін’єкційовані в ТК – клітини, при цьому ТК– ген проник в ядра і нормально в них реплікувався.

Трансформація соматичних клітин ссавців відкриває можливість для вивчення механізмів регуляції експресії генів і цілеспрямовано модифікувати генетичний апарат клітини тварин, в тому числі і людини.

В даний час розроблені способи введення генів в ембріональні клітини ссавців, мух і деяких рослин з метою зміни властивостей організму, таких, як швидкість росту, стійкість до захворювань і зовнішніх впливів. Подібного роду роботи були початі з досить великими яйцями амфібій, а потім продовжені з яйцеклітинами і ембріонами миші.

Мікроін’єкцію клонованих генів проводять в один або два пронуклеоси тільки до заплідненої яйцеклітини миші. Після ін’єкції яйцеклітину швидко імплантують в яйцевід прийомної матері або дають можливість розвиватися в культурі до стадії бластоцисти, після чого імплантують в матку. Таким чином були ін’єкційовані гени інтерферону та інсуліну людини, ген глобіну кролика, ген тимідинкіназного вірусу герпесу і к ДНК вірусу лейкемії мишей. Виживає звичайно від 10 до 30% яйцеклітин, а доля мишей, які народилися з трансформованих яйцеклітин, складає від декількох до 40%.

Виявлено, що рівень експресії чужорідного гену залежить від місця інтеграції ДНК з хромосомами, від диференціювання тканин.

Недивлячись на певні успіхи в галузі інтеграції чужорідних генів в ембріональні клітини тварин, до цих пір не вдавалося вбудувати чужорідну ДНК в дану ділянку хромосоми, витіснити ген і замінити його новою нуклеотидною послідовністю, підкорити новий ген системі регуляції організму. Подолання цих труднощів дозволить успішно здійснювати генотерапію людини – лікування декількох десятків генетичних захворювань, обумовлених відсутністю або дефектами генів.