Ііі етап – закріплення знань та навичок

Після вивчення теми необхідно

Знати	Вміти
Значення соматичних клітин для дослідження генетики людини , їх культивування. Значення гібридизації соматичних клітин не тільки внутрі виду, а й в міжвидовій гібридизації.	Пояснювати хід експерименту проведеного французьким вченим Ж. Барським , та його значення для медицини.
Поняття імуногенетика, антиген, антитіло. Яка спрямованість біохімічних методів дослідження. Які існують програми первинної біохімічної діагностики спадкових хвороб.	Характеризувати дію комплексу «антиген – антитіло». Визначати етапи біохімічної діагностики. Визначати симптоми , які є показниками до Біохімічної діагностики.
Поняття пов’язані з дерматогліфікою. Стислі характеристики рель ефів пучок пальців та долоней. Дерматогліфічні особливостей в осіб з спадковими хворобами.	Отримувати відбитки папілярних ліній пучків пальців та рель ефу долоней. Робити найпростіші розрахунки за отриманими даними, такі як дельтовий індекс та кут аtd.

4.Додаткові завдання (матеріали позааудиторної роботи)

Ознайомтесь зі статтею : « Генетичні маркери » .

( Дивись додаток № 3 .)

Додатки до СПРС № 7 :

Додаток № 1

Метод гібридизації соматичних клітин.

Со­матичні клітини містять увесь об'єм генетичної інформації. Це дає можливість вивчати багато пи­тань генетики людини, які неможливо досліджува­ти на цілому організмі. Соматичні клітини людини отримують із різних органів (шкіра, кістковий мо­зок, клітини крові, тканини ембріонів). Найчастіше використовують клітини сполучної тканини (фібро­бласти) і лімфоцити крові. Культивування клітин поза організмом дозволяє отримувати достатню кіль­кість матеріалу для дослідження, який не завжди можна взяти в людини без шкоди для здоров'я.

Клітини культури тканини можна використовува­ти для вивчення різними методами: цитологічним, біохімічним, імунологічним тощо. Таке дослідження може бути у ряді випадків більш точним, ніж на рівні цілісного організму, бо метаболічні процеси вдається виділити із складного ланцюга взаємопов'я­заних реакцій, які відбуваються в організмі.

У 1960 р. французький біолог Ж. Барський, ви­рощуючи поза організмом у культурі тканини кліти­ни двох ліній мишей, виявив, що деякі клітини за своїми морфологічними і біохімічними ознаками були проміжними між вихідними батьківськими клітина­ми. Ці клітини виявилися гібридними. Таке спон­танне злиття клітин у культурі тканини відбуваєть­ся досить рідко. Згодом виявилося, що частота гібридизації соматичних клітин підвищується при введенні в культуру клітин РНК-вмісного вірусу парагрипу Сендай, який, як і взагалі всі віруси, змінює властивості клітинних мембран і робить можливим злиття клітин. Вірус Сендай попередньо опроміню­вали ультрафіолетом. Він втрачав свої вірулентні властивості, але зберігав здатність впливати на злиття клітин. У змішаній культурі двох типів утво­рюються клітини, які містять у спільній цитоплазмі ядра обох батьківських клітин - гетерокаріони. Більшість гетерокаріонів гине, але ті, які містять тільки два ядра, часто продовжують свій розвиток, розмножуючись поділом. Після мітозу і наступного поділу цитоплазми із двоядерного гетерокаріону утворюються дві одноядерні клітини, кожна з яких являє собою синкаріон - справжню гібридну кліти­ну, яка має хромосоми обох батьківських клітин.

Гібридизація соматичних клітин проводиться в широких межах не тільки між різними видами, але й типами: людина і миша, людина і комар, муха і курка тощо. Залежно від мети аналізу, дослідження прово­дять на гетерокаріонних або синкаріонних клітинах. Синкаріони зазвичай вдається отримати при гібри­дизації у межах класу. Це справжні гібридні клітини, бо в них відбулося поєднання двох геномів. Напри­клад, гібридні клітини людини і миші мають 43 пари хромосом: 23 - від людини і 20 - від миші. Згодом, при розмноженні цих клітин частка вихідних геномів різна. Відбувається поступова елімінація хромосом того організму, клітини якого мають повільніший темп розмноження. За допомогою цього методу прово­диться картування хромосом у людини.

Використання методу гібридизації соматичних клітин дає можливість вивчати механізми первин­ної дії і взаємодію генів. Культури соматичних клітин використовуються для визначення мутагенної дії факторів навколишнього середовища. Розширюють­ся можливості точної діагностики хвороб на біохі­мічному рівні у дорослих і до народження у плодів (пренатальна діагностика). Для подальшого удос­коналення цих методів необхідно нагромаджувати лінії клітин з генними і хромосомними мутаціями. Вже організовані "банки" клітинних ліній.

Біохімічні методи (імунологічні).

Імуногенетика - наука, яка поєднує імунологічні і генетичні методи дослідження. Вона вивчає спад­кову зумовленість груп крові, типи гемоглобіну, фер­ментів, білків сироватки крові, молока та ін. Імуно­генетика використовує методи імунології для вирі­шення генетичних завдань.

Кожний орган, тканина, клітина і біологічна ріди­на містять тільки їм властиві антигенні речовини. Антигени успадковуються від батьків. Синтез ан­тигенів визначається окремими генами, які успад­ковуються за менделівськими правилами, незалеж­но один від одного або зчеплено. Впродовж життя антигени залишаються сталими; вони не зміню­ються з віком, не залежать від дії факторів зовніш­нього середовища. У різних організмів одного виду, за винятком монозиготних близнюків, набір анти­генів різний.

В організмі у відповідь на введений антиген ви­робляється специфічний захисний компонент - ан­титіло, яке зв'язується з антигеном і нейтралізує його. Антитіла - це білки, синтез яких контролюється генами.

Тому всі імунологічні процеси, які відбуваються в організмі, зумовлені спадковістю.

Організм ніколи не виробляє антитіл проти тих антигенів, які є у нього, а тільки проти чужорідних. Антитіла завжди специфічні і взаємодіють тільки з тими антигенами, проти яких вони утворилися в організмі. Для виявлення антигенів використовують спеціальні сироватки, які містять певні антитіла (моноспецифічні сироватки).

Антиген та антитіло взаємодіють між собою, що супроводжується гемолізом, реакцією осадження (преципітації), відторгнення трансплантату і т. п.

Біохімічні методи спрямо­вані на виявлення біохімічного фенотипу організму. Вперше біохімічні методи почали застосовувати для діагностики генних хвороб ще на початку XX сто­річчя. За останні роки їх широко використовують для пошуку нових мутантних алелів. За їхньою до­помогою описано понад 1000 спадковиих хвороб об­міну речовин. Для більшості з них виявлений дефект первинного генного продукту. Найбільш поши­реними серед таких захворювань є хвороби, пов'я­зані з дефектом ферментів, структурних, транспор­тних або інших білків. Дефекти ферментів установ­люють шляхом визначення вмісту в крові і сечі про­дуктів метаболізму, що є результатом функціону­вання даного білка. Дефіцит кінцевого продукту, що супроводжується накопиченням проміжних і по­бічних речовин порушеного метаболізму, свідчить про дефект ферменту або його дефіцит в організмі. Об'єктами біохімічної діагностики є сеча, піт, плазма і сироватка крові, формені елементи крові, куль­тури клітин (фібробласти і лімфоцити). Програми первинної біохімічної діагностики спадкових хвороб можуть бути масовими і селективними. Відомі ма­сові просіюючі програми для діагностики фенілкетонурії, спадкового гіпотиреозу і та ін.

Наприклад, біологічним матеріалом для скринінг-діагностики фенілкетонурії є висушені плями капі­лярної крові новонароджених на хроматографічно­му папері. У плямах крові визначають кількість фе­нілаланіну за допомогою одного із методів: мікро­біологічний тест Гатрі, флуориметрія, роздільна хро­матографія на папері, тонкошарова хроматографія.

Селективні діагностичні програми передбачають перевірку біохімічних аномалій обміну (сеча, кров) у пацієнтів з підозрою на генні спадкові хвороби. У се­лективних програмах використовуються прості якісні реакції (тест із хлоридом заліза для виявлення фенілке­тонурії). Наприклад, за допомогою тонкошарової хро­матографії сечі і крові діагностують спадкові порушен­ня обміну амінокислот, глікозаміногліканів. Газова хро­матографія застосовується для виявлення спадкових хвороб обміну органічних кислот. Шляхом електрофо­резу гемоглобінів діагностуються гемоглобінопатії.

Біохімічна діагностика спадкових порушень об­міну включає два етапи. На першому етапі відби­рають ймовірні випадки захворювань, на другому більш точними і складними методами уточнюють діагноз захворювання. Для визначення в крові, сечі або амніотичній рідині проміжних, побічних і кінце­вих продуктів обміну, крім якісних реакцій із спе­цифічними реактивами на певні речовини, викорис­товують хроматографічні методи дослідження амі­нокислот та інших органічних речовин.

Показаннями для застосування біохімічних ме­тодів діагностики новонароджених є такі симпто­ми: судоми, кома, блювота, гіпотонія, жовтяниця, специфічний запах сечі і поту, ацидоз, припинення росту. У дітей біохімічні методи використовуються у випадках підозри на спадкові хвороби обміну ре­човин (затримка фізичного і розумового розвитку, втрата набутих функцій, специфічна для будь-якої спадкової хвороби клінічна картина).

Порушення первинних продуктів генів виявляють за допомогою біохімічних методів, а локалізацію відповідних ушкоджень у спадковому матеріалі -за допомогою методів молекулярної генетики.

Метод дерматогліфіки.

Дерматогліфіка - на­ука, що вивчає спадкову обумовленість малюнку, який утворюють лінії шкіри на кінчиках пальців, долонях і підошвах людини. Дерматогліфіка поді­ляється на: дактилоскопію - вивчення малюнка пальців; пальмоскопію - вивчення особливостей будови долонь; плантоскопію - вивчення особ­ливостей будови підошов. Метод запропоновано в 1892 р. Ф. Гальтоном як один із шляхів вивчення шкірних гребінчастих візерунків пальців і долонь, а також згинальних долонних борозен. Встановле­но, що візерунки є індивідуальною характеристи­кою людини і не змінюються впродовж життя. Дерматогліфічні дослідження мають важливе значен­ня у визначенні зиготності близнюків, у діагнос­тиці багатьох спадкових захворювань, а також в окремих випадках спірного батьківства.

Долонний рельєф дуже складний. У ньому виді­ляють багато полів, подушечок і долонних ліній. По­душечок на долоні 11 і їх поділяють на три групи:

1. П'ять кінцевих (апікальних) подушечок на кінцевих фалангах пальців.

2. Чотири міжпальцеві подушечки розміщують­ся навпроти міжпальцевих проміжків.

3. Д ві долонні проксимальні подушечки – тенар і гіпотенар.

Долоня дистальне обмежена п'ястково-фалан­говими згинальними складками, а проксимальне - зап’ястковою, або браслетною, згинальними склад­ками. Як на долонях, так і на пальцевих подушеч­ках шкірні гребінці розміщені потоками. Точки зустрічі цих потоків утворюють трирадіуси, або дельти (рис. 1.132). На кожній із 4 міжпальцевих подушечок звичайно є трирадіуси, їх позначають малими літерами латинського алфавіту (а, b, с, d, починаючи від вказівного пальця (а) і закінчуючи мізинцем (d). Поблизу браслетної складки розта­шований головний (осьовий) долонний трирадіус. Якщо провести лінії від трирадіусів а і d до t, то утворюється кут долоні < atd, який в нормі не пере­вищує 57° (рис. 1.131).

Гребінчасті візерунки зазвичай вивчають під лупою. Як на кінчиках пальців, так і на долонних підвищеннях можуть спостерігатися різноманітні па­пілярні візерунки у вигляді завитків, петель і дуг, відкритих в ульнарний або радіальний бік. Те ж саме спостерігається на тенарі й гіпотенарі. Проте тут частіше бувають дуги.

На середній і головній фалангах пальців гребін­часті лінії знаходяться поперек пальців, створюючи різноманітні візерунки - прямі, серпоподібні, хвиле­подібні, дугоподібні - і сполучення.

Більша кількість праць присвячена вивченню візерунків на кінчиках пальців. Ф. Гальтон виділив три форми папілярних візерунків: завитки, петлі і дуги, їх позначають відповідно: W; L; А. Петлі бувають відкриті як в ульнарний, так і в радіальний бік. їхній напрямок позначають першою літерою цих слів. Символом U позначають петлю, відкриту в ульнар­ний бік, символом R. - петлю, відкриту в радіальний бік (рис. 1.132). Виділяють чотири головних паль­цевих папілярних візерунки - W; R; U; А. У дугах потоки гребінчастих ліній не перетинаються. Отже, в дузі немає трирадіуса, або дельти. У петлі є одна дельта, а в завитку дві дельти.

Загальноприйняті показники особливостей шкір­них візерунків на пальцях:

1. Загальний гребінцевий рахунок (загальна кількість папілярних ліній) - сума на всіх 10 пальцях папілярних ліній між центром візерунка і дельтою.

2. Індекс інтенсивності візерунка - сума дельт на 10 пальцях обох рук.

3. Частота окремих візерунків – співвідношення кількості візерунків того чи іншого типу (дуги, петлі радіальні, петлі ульнарні, завитки) до загальної кількості всіх візерунків.

У популяційних дослідженнях обчислюють індек­си, що відображають в основному дельтовий показ­ник, тобто співвідношення петель і завитків на всіх 10 пальцях за формулою А+2W/10. Найчастіше за­стосовується формула Dt 10 = А +2W/(А+L+W) 10.

У групових дослідженнях користуються вивчен­ням кількісного значення візерунка, тобто числа гребінців від дельти до центру візерунка (гребінце­вий рахунок). У середньому на одному пальці буває 15-20 гребінців, на всіх 10 пальцях у чоловіків -144,98, а у жінок-127,23.

При вивченні шкірного рельєфу долоні досліджують:

1. Хід головних долонних ліній А,B, С, D.

2. Долонні візерунки на тенарі і гіпотенарі.

3. Пальцеві візерунки (форму візерунків і гребін­цевий рахунок).

3. Осьові трирадіуси.

На характер пальцевого і долонного візерунків впливають механізми цитоплазматичної спадко­вості. Дослідження людей з хромосомними захво­рюваннями дозволило виявити специфічні зміни не тільки візерунків пальців і долонь, але й характер основних згинальних борозен на шкірі долонь. Ха­рактерні зміни даних показників спостерігаються при хворобі Дауна, синдромах Клайнфельтера, Шерешевського - Тернера, що дозволяє використо­вувати методи дерматогліфіки та пальмоскопії для діагностики цих захворювань (табл. 1.17).

Додаток № 2

Практична робота для самостійного виконання

« Дерматогліфіка як метод генетики людини»

Хід роботи:

1. Розгляньте на мал. 42 варіанти візерунків на шкірі пальців рук. Намалюйте в протоколі три основні типи візерунків: дугу, петлю, завиток і позначте їх відповідно літерами А, L, W.

2. Розгляньте мал. 43, на якому зображено відбитки папіляр­них ліній пальців правої та лівої руки. Пальцеві візерунки правої та лівої руки, зображені на малюнку, запишіть за таким зразком:

І II III IV V

Права рука W L^u L^r L^r L^r

Ліва рука L^r L^r L^r L^r L^r

Р имськими цифрами позначені відповідно перший (І), дру­гий (II), третій (III), четвертий (IV), п'ятий (V) пальці лівої та правої руки. Візерунки на пальцях позначають відповідно літерами: W (англ. whori — завиток); А (англ. аrсh — дуга); L (англ. lоr — петля). Якщо петля відхиляється в бік променевої кістки, вона називається радіальною (L^r), якщо в бік ліктьової кістки — ульнарною (L^u).

Дельтовий індекс, який вказує на кількість трирадіусів, або дельт (їх так називають за подібністю фігури до грецької літе­ри Δ), у певної людини визначають за формулою:

DI = L + 2W/А + L + W х 10,

де L — загальна кількість усіх петель на правій та лівій руці; W — загальна кількість усіх завитків на правій та лівій руці; А — за­гальна кількість усіх дуг на правій та лівій руці. У нашому випад­ку дельтовий індекс становить:

DI = (9 + 2 х 1)/(0 + 9 + 1) х 10 = 11.

Слід пам'ятати, що папілярні лінії різних напрямків ніколи не перетинаються, але в певних місцях можуть зближуватися, утворюючи трирадіуси (дельти). Кожний завитковий візерунок має дві дельти, петля — одну, а дуга не утворює жодної.

Кількісним показником дерматогліфів є підрахунок гребенів (кількість папілярних ліній між дельтою і центром візерунка). Порахуйте кількість гребенів від дельти до центра візерунка на кожному пальці малюнка і визначте їхнє сумарне середнє зна­чення для десяти пальців. Гребеневий підрахунок зробіть так: від дельти до центра візерунка проведіть пряму лінію і порахуйте кількість гребенів, які перетинають цю лінію. Кількість гребенів записується під відбитком кожного пальця. При цьому не раху­ють ні трирадіуса, ні кінцевого гребеня, що утворює центр візе­рунка. У петлях кінцевий гребінь враховується. У нашому випад­ку гребеневий рахунок такий:

(10 + 16 + 7 + 15 + 24) + (18 + 14 + 9 + 18 + 14) = 145.

3 . Отримайте відбиток папілярних ліній пучок власних паль­ців рук. Для цього вимийте ретельно руки з милом і витріть їх насухо. Друкарську фарбу розведіть гліцерином до консистенції густої сметани. На скляну пластинку розміром 15 х 25 см скля­ною паличкою нанесіть у 2—3 місця фарбу і рівномірно розподі­літь її гумовим валиком. По кожному пальцю тричі проведіть ва­ликом, прикладаючи його послідовно до радіальної, медіальної та ульнарної поверхні кінцевої фаланги. Потім зробіть на папері відбиток кожного пальця з радіального боку, обережно повернув­ши його до ульнарного краю. Відбитки пальців робіть у певному порядку — зліва направо, спочатку пальців лівої руки, а потім пальців правої руки.

Дослідивши відбитки папілярних ліній своїх пальців рук, роз­рахуйте свій дельтовий індекс і порахуйте кількість гребенів.

4. Отримайте відбиток рельєфу своєї долоні. Для цього гумо­вим валиком проведіть кілька разів по скляній пластинці з фар­бою, а потім рівномірно нанесіть ним фарбу на долоні й пальці. Розмістіть долоню з фарбою ульнарним краєм над аркушем па­перу і повільно опустіть її на нього. Натисніть іншою рукою на середину тильного боку кисті, щоб глибокі частини долоні щільно притиснулися до паперу. Великий палець обережно, не зсовую­чи з місця, притисніть до паперу нігтьовою фалангою, одночас­но повертаючи його в бік вказівного. Потім різко підніміть кисть від паперу вертикально вгору. Відбиток правої долоні виконується аналогічно. Фарбу з долоні зніміть ватою, змоченою скипидaром; руки помийте теплою водою з милом.

5. Знайдіть кут аtd на відбитку вашої долоні. Біля основи ІI, III, IV і V пальців локалізуються пальцеві трирадіуси — це місця, в яких сходяться три напрямки папілярних ліній, їх позначаю і відповідно латинськими літерами а, b, с, d (мал. 44). Поблизу браслетної складки міститься головний осьовий долонний трирадіус; він позначається латинською літерою t. Знайдіть і з'єд­найте лініями точки а, t, d на відбитку вашої долоні. За допомо­гою транспортира виміряйте значення кута аtd. (у нормі він не повинен перевищувати 57 °С).

Додаток № 3.

Генетичні маркери.

Для діагностики спадкових та інфекційних за­хворювань на рівні ДНК використовують різні ме­тоди, зокрема ДНК-зонди (маркери). ДНК-зонд -це ділянка ДНК довжиною від 10 до 6000 пар нуклеотидів, у якій послідовність основ комплемен­тарна послідовності досліджуваної ділянки ДНК (гена, що зумовлює захворювання, або гена віру­су, бактерії).

Технологія ДНК-зондів вимагає знання нуклеотидної послідовності гена, що досліджується. Для локалізації гена зонди, що містять радіоактивні або флуоресцентні мітки, вносяться у ДНК-зразки, що містять біологічний матеріал, отриманий від хворо­го. За наявності в ДНК комплементарної послідов­ності зонд приєднується до неї і його можна визна­чити, вимірюючи радіоактивність або флуоресцен­цію. Розміри фрагментів ДНК, до яких приєднався зонд, визначають за допомогою методики, що от­римала назву блотинг, розроблена американським вченим Саузерном. За допомогою ДНК-зондів іден­тифіковані деякі гени людини. Вони використовують­ся також для діагностики інфекційних захворювань внаслідок визначення послідовності ДНК, унікаль­ної для кожної бактерії або віруса, наприклад, віруса гепатиту В - дуже тяжкого і поширеного захво­рювання людини. Послідовність нуклеотидів ДНК цього вірусу розшифрована. На даний час випуска­ються готові діагностичні набори, що містять одноланцюгову ДНК, мічену флуоресцентним барв­ником, комплементарну одному з ланцюгів вірусної ДНК. Таку одноланцюгову ДНК додають до зраз­ка крові хворого з симптомами гепатиту В. Пробу крові нагрівають для поділу ДНК вірусу на окремі ланцюги. ДНК-зонд приєднується до комплементар­ного ланцюга ДНК вірусу і відновлює подвійний ланцюг ДНК. Флуоресціюючі ДНК можна побачи­ти, знявши на фотоплівку.

Одним із важливих досягнень в області ДНК-технологій є розробка полімеразної ланцюгової ре­акції (ПЛР).

Використовуючи ПЛР, можна синтезувати міль­йони копій одного гена або будь-яких специфічних ділянок ДНК у пробірці впродовж короткого часу. ПЛР отримала свою назву від ДНК-полімерази, фер­менту, що сприяє реплікації ДНК у клітині. Реакція ланцюгова, тому що полімераза буде відтворювати реплікацію кожної копії ДНК, що утворилася, нескін­ченну кількість разів.

Для проведення ПЛР необхідні праймери - ко­роткі послідовності з 20 нуклеотидів, комплементар­ні нуклеотидам на обох кінцях ділянки ДНК-мішені. Праймери необхідні для початку процесу реплікації, що буде продовжений ДНК-полімеразою.

Варто зазначити, що для аналізу кожної ділянки ДНК застосовуються свої специфічні праймери. Це дало можливість значно вдосконалити і прискорити діагностику багатьох інфекційних захворювань, зро­бити більш доступними генетичні дослідження в медичній практиці.

Методична розробка для організації самостійної роботи студентів № 8

2. години

Дисципліна : Медична біологія

Тема: Поняття про мультифакторіальні хвороби.

Викладач: Рибальченко Віталій Валентинович

Курс, група: І курс, групи 11, 12, 13 спеціальність: 5.110.102 «сестринська справа»

1. Актуальність теми: у розвитку одних ознак визначальну роль виконує генотип, а

для розвитку інших істотне значення має зовнішнє середовище.

Однак нема таких ознак , які остаточно зумовлювались тільки

першим або другим чинником. Такі ознаки є мультифакторіаль-

ними - за цих умов формування фенотипу відбувається шляхом

взаємодії всіх чинників.