Окраска микроорганизмов по Граму.
В зависимости от химического состава и строения клеточной стенки прокариоты делятся на грамположительные и грамотрицательные бактерии. Такое деление связано со способностью бактерии окрашиваться по Граму. Эта окраска является важным диагностическим признаком, она коррелирует со многими другими свойствами бактерий.
Основные отличия в строении клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий схематически изображены на рисунке 3.
Рис.3:Схематическое изображение клеточной стенки грамположительных (А) и грамотрицательных (Б) бактерий: 1-цитоплазматическая мембрана, 2-пептидогликан, 3-переплазпатическое пространство, 4-наружная мембрана, 5-ДНК.
Сущность окраски по Граму заключается в том, что при обработке клеток прокариот сначала красителем генциановым фиолетовым, а затем йодом, образуется окрашенный комплекс, который при последующей обработке спиртом удерживается грамположительные, вымываются из клеток грамотрицательные бактерии, которые в результате обесцвечиваются. При последующей обработке фукцином они приобретают розово-красную окраску, а грамположительные имею сине-фиолетовую окраску.
Рис.4: Однослойная структура пептидогликана. Линиями обозначены гетерополимерные цепочки, образованные чередующимися остатками N-ацетилглюкозамина (Г) и N-ацетилмурамовой кислоты (М), соединенными между собой β-1,4-гликозидными связями. Кружочками обозначены аминокислоты пептидного хвоста.
Приготовление препаратов бактерии, окрашенных по Граму.
Приготовление мазка.
Фиксация препарата.
Окрашивание препарата генциановым фиолетовым (1-2 мин).
Обработка раствором Люголя до почернения.
Обработка 96% этиловым спиртом (0,5 – 1 мин).
Промывание препарата водой.
Окрашивание фуксином (1-2 мин).
Промывание препарата водой.
Высушивание водой.
Микроскопирование препарата с иммерсионной системой.
При правильном окрашивании грамположительные окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные – красный.
Стерилизация питательных сред, посуды и инструментов.
Под стерилизацией понимают методы, применяемые для уничтожения всех мко. Микробиологи стерилизуют питательные среды, посуду, инструменты с целью не допустить развития посторонних мко в исследуемых растворах.
Существуют
следующие методы термической стерилизации:
прокаливание в пламени горелки и
обжигание, сухожаровая стерилизация
(горячим воздухом), стерилизация
насыщенным паром под давлением
(автокловирование), дробная стерилизация,
кипячение. К методам холодной стерилизации
относят стерилизацию фильтрованием
(пропускание жидкости через специальные
микропористые фильтры), УФ-ыми лучами
и газообразными средствами. Дробная
стерилизация применяется для стерильных
сред, портящиеся под действием температуры
выше 100
С,
она заключается в многократном прогревании
сред без избыточного давления.
Пастеризация – однократный прогрев материала при температуре ниже 100 С (15-30 мин) при 60-70 С; 10-15 мин при 80 С.
Устройство автоклавов. Автоклавы разнообразны по форме, размерам, рабочему давлению, конструкции и другим показателям. Они могут быть м ручным управлением, полуавтоматические и автоматические. Но поскольку все автоклавы предназначены для выполнения одной и той же задачи- стерилизации, основной принцип их устройства один и тот же. Разберем его на примере автоклава с ручным управлением (рис.5)
Рис. 5: Схема автоклава:1-стерилизационная камера; 2-кран для выхода воздуха; 3-манометр;4-предохранительный клапан; 5-водопаровая камера; 6-воронка для заполнения автоклава водой; 7-водомерная трубка; 8-отверстия для поступления пара в стерилизационную камеру; 9-защитный кожух;
10-крышка автоклава; 11-подставка для размещения стерилизуемых предметов.