4. Правила работы с культурами микроорганизмов.

В лабораториях микроорганизмы выращивают на жидких и плотных питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы, чашки Петри. Посуду и питательные среды предварительно стерилизуют. Процесс выращивания микроорганизмов в искусственных условиях в питательной среде называется культивированием. При этом выращенные клетки определенного вида мко называются культурой микроорганизмов.

Все действия следуют проводить около пламени горелки и по возможности быстро, чтобы не загрязнить культуру посторонними культурами. Не рекомендуется делать резких движений и ходить около работающего с чистой культурой, т.к. движение воздуха увеличивает вероятность случайного загрязнения. Для розлива питательной среды в чашки Петри сосуд со средой берут в правую руку, вынимают из него пробку, зажимая ее мизинцем и безымянным пальцем левой руки. Затем обжигают горло сосуда в пламени горелки и, приоткрыв большим и указательным пальцами левой руки крышку чашки Петри, быстро наливают в чашку расплавленную среду в таком количестве (около 20 мл), чтобы дно чашки было полностью покрыто. Крышку тотчас закрывают и чашку оставляют на горизонтальной поверхности до тех пор, пока не застынет среда.

Внесение клеток мко в стерильную среду называется посевом. Распределение мко по поверхности питательной среды нарывают рассевом. Перенос уже выращенных из одной среды в другую – пересевом. Клетки мко для посева или приготовления препаратов берут бактериологической петлей (если мко выращены на плотной среде) или стерильной пипеткой. Перед взятием клеток мко петлю стерилизуют, обжигая саму петлю и часть держателя в пламени горелки. Чтобы не повредить клетки мко петлю вначале охлаждают, прикасаясь ею к внутренней поверхности сосуда или к питательной среде, свободной от клеток мко, и только после этого захватывают небольшое количество микробной массы.

5. Обработка предметных стекол.

Предметные и покровные стекла считаются чистыми, когда капля воды растекается по их поверхности. Новые стекла обычно кипятят в 1 %- ном растворе соды, промывают дистиллированной водой, слабым раствором соляной кислоты и затем опять дистиллированной водой. Стекла, бывшие в употреблении, кипятят в мыльной воде и затем не менее суток выдерживают в растворе хромовой смеси. От бихромата стекла отмывают дистиллированной водой. Чистые стекла хранят в 96 %-ном этаиоле.

Обработка предметных стекол по методу Цетнова:

1. Стекла кипятят 10 мин в следующем растворе: бихромата калия -20 г, дистиллированной воды-200 мл, концентрированной серной кислоты-20 мл.

2. Промывают в течение 5 мин слабым раствором едкого натра.

3. Тщательно промывают водой.

4. Промывают спиртом.

При отсутствии заранее приготовленных обезжиренных стекол можно быстро подготовить стекла, натирая их в сухом виде хозяйственным мылом и очищая затем чистой хлопчатобумажной тканью.

6. Приготовление микроскопических препаратов.

1. Препарат «раздавленная капля». На предметное стекло наносят каплю воды и помещают в нее небольшое колическтво культуры изучаемых мко, размешивают и накрывают покровным стеклом культуру, переносят в каплю воды бактериологической петлей, культуру, выращенную в жидкой среде, стерильной пипеткой. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, что бы после прижимания покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из под него.

2. Препарат «висячая капля». Каплю суспензии мко петлей или обычным пером наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением в центре. Края лунки предварительно смазывают вазелином.

3. Препарат «отпечаток». Из агаризованной среды вырезают скальпелем небольшой кубик и переносят его на предметное стекло, чтобы поверхность с мко была обращена вверх. Затем к газону чистое покровное стекло, слегка надавливают на него петлей или пинцетом и тот час же снимают, стараясь не сдвинуть в сторону. Полученный препарат помещают отпечатком вниз в каплю воды (1:40) на предметное стекло.

4. Препараты фиксированных окрашенных клеток. 1) приготовление мазка. На обезжиренное предметное стекло помещают каплю воды и переносят в нее петлёй небольшое количество исследуемого материала. Получив суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1-2 см . 2) высушивание мазка. Лучше всего сушить препарат при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный мазок высыхает очень быстро. 3) фиксация: а- убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасное дальнейшее обращение с ними; б – обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; в – сделать мазок более восприимчивым к окраске, т.к. мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Термическая обработка 3 раза препарат проводят через горячее пламя горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Фиксирующую жидкость наливают на мазок на определенное время погружает в стакан с фиксатором. 4) окраска. Различают кислые и основные. Кислые – анионные (хромофор). Основные – катионные. Кислые – кислый фуксин, эозин. Основные – метиленовый синий, основный фуксин. Различают простые и дифференциальные способы окрашивания. Простой способ – окрашивается вся клетка полностью, дифференциальный – окрашивается некая часть. Фиксированный препарат помещают на параллельные рейки, лежащие над кюветой и заливают красителем на 1-3 мин. В конце препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной, затем его высушивают.