4. Хроматография

Х роматография – физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на повторяющихся процессах сорбции и десорбции разделяемых веществ между подвижной и неподвижной фазами.

М ихаил Семёнович Цвет (1872—1919) — русский ботаник-физиолог и биохимик растений. Создал хроматографический метод. Исследовал пигменты листьев растений, получил в чистом виде хлорофиллы a, b и c и ряд изомеров ксантофилла. Открытие Цвета получило широкое признание, и активно применялось с начала 1930-х годов при разделении и идентификации различных пигментов, витаминов, ферментов, гормонов и др. органических и неорганических соединений. Оно послужило основой для создания ряда новых направлений хроматографии. Для физиологии растений существенны выводы Цвета о природе хлоропластов, состоянии хлорофилла в растении, механизме фотосинтеза и др.

Сущность хроматографии заключается в том, что через слой адсорбента, являющегося неподвижной фазой, пропускают поток элюента – жидкость или газ (подвижная фаза), содержащего разделяемую смесь. Так как различные вещества на одном и том же адсорбенте адсорбируется в разной степени, то при адсорбционном равновесии они разное время будут находиться на поверхности адсорбента. Вещество, имеющее большее сродство к адсорбенту, будет адсорбироваться первым, и будет дольше удерживаться на поверхности адсорбента. Вещество, имеющее слабое сродство к адсорбенту, будет адсорбироваться последним и слабо удерживаться на его поверхности. В результате этого смесь разделяется на зоны, каждая из которых преимущественно содержит чистое вещество. При продолжительном пропускания элюента зоны движутся по слою адсорбента вследствие непрерывно повторяющихся актов адсорбции-десорбции и выходят с потоками элюента в определенной последовательности; первыми - слабо сорбирующиеся; последними - сильно сорбирующиеся. На выходе с адсорбента концентрацию компонента определяют с помощью различных физико-химических методов.

Хроматографические методы классифицируют по следующим признакам:

• природа подвижной и неподвижной фаз;

• механизм процесса разделения;

• техника выполнения.

В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают:

В газовой хроматографии подвижной фазой является газ, а неподвижной - твердое тело или жидкость. В соответствии с этим газовую хроматографию делят на газо-адсорбционную с твердым адсорбентом и газо-жидкостную. Жидкостную хроматографию делят на жидкостно-адсорбционную (неподвижная фаза-твердый адсорбент) и жидкостно-жидкостную. Жидкостная неподвижная фаза в газо-жидкостной и жидкостно-жидкостной хроматографии может быть образована путем закрепления жидкости в порах твердого инертного носителя.

По механизму процесса разделения различают следующие виды хроматографии: адсорбционная, распределительная, ионнообменная, молекулярноситовая (гель-хроматография), хемосорбционная.

В зависимости от типа химической реакции в хемосорбционной хроматографии выделяют разновидности: осадочная, редокс-хроматография, лигандообменная хроматография, биоспецифическая (аффинная) хроматография. В этих случаях разделение основано на различиях в константах равновесия соответствующих процессов: осаждения, окислительно-восстановительных, комплексообразования, образования комплекса субстрат-фермент.

По технике выполнения различают:

Плоскостная в свою очередь включает бумажную и тонкослойную хроматографию. Наиболее широко используется колоночная хроматография, в процессе которой разделение веществ происходит в узкой и длинной хроматографической колонке, заполненной адсорбентом. В бумажной хроматографии в качестве адсорбента используют специальную однородную бумагу, а в тонкослойной хроматографии применяют тонкие слои адсорбентов, нанесенные на пластинки из инертных материалов.

Наиболее широкое применение в медико-биологических исследованиях находят: бумажная, тонкослойная, ионообменная хроматография, гель-хроматография и аффинная хроматография.

Бумажная хроматография основана на различии в скорости перемещения компонентов анализируемой смеси по бумаге в потоке растворителя. В бумажной хроматографии используют специальную бумагу, которая содержит только целлюлозные волокна. Она может служить неподвижной фазой или носителем неподвижной фазы.

В распределительной бумажной хроматографии неподвижная фаза – адсорбированная бумагой вода, а подвижная фаза – органический растворитель. Скорость перемещения компонентов смеси зависит от коэффициентов их распределения между фазами.

В адсорбционной бумажной хроматографии разделение компонентов смеси происходит благодаря различию в их сорбируемости адсорбентом – бумагой. В качестве подвижной фазы используются смеси органических растворителей с водой.

В ионообменной бумажной хроматографии используют бумагу, пропитанную ионообменной смолой. Скорость перемещения компонентов смеси в этом случае зависит от констант ионного обмена.

Осадочная бумажная хроматография осуществляется на бумаге, пропитанной раствором реагента-осадителя, образующего с разделяемыми веществами малорастворимые соединения. Скорость движения компонентов определяется константами растворимости этих соединений.

В лигандообменной бумажной хроматографии бумагу предварительно обрабатывают растворами ионов металлов, например Са²⁺, при разделении аминов и аминокислот. При этом компоненты перемещаются в зависимости от констант устойчивости их комплексных соединений с ионами металлов.

С помощью бумажной хроматографии можно разделять и анализировать практически все классы химических соединений, в том числе аминокислоты, сахара, стероиды, витамины, антибиотики.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) основана на различии в скорости перемещения компонентов анализируемой смеси вдоль тонкого слоя сорбента в потоке растворителя.

Тонкий слой сорбента в ТСХ может выполнять функцию адсорбента, ионита, носителя жидкой фазы.

Адсорбционная ТСХ основана на сорбции растворенного вещества поверхностью сорбента.

Распределительная ТСХ основана на распределении вещества между двумя несмешивающимися жидкостями, в которых оно растворяется. При этом одна из жидкостей удерживается твердым носителем.

Ионообменная ТСХ основана на образовании ионных соединений между растворенными веществами и заряженными группами сорбента.

Выбор сорбента и элюента в ТСХ зависит от вида хроматографии. В адсорбционной ТСХ в качестве сорбентов применяют силикагели, оксид алюминия, целлюлозу, которые наносят тонким слоем на стеклянную пластинку или алюминиевую фольгу. Некоторые фирмы выпускают готовые пластинки с адсорбентом.

В распределительной ТСХ применяют двухфазную систему, в которой разделяемые вещества обладают необходимым коэффициентом распределения.

Для анализа методом ионообменной ТСХ используют специальные сорта ионообменной целлюлозы, а также иониты на основе сефадексов - сшитых декстранов. Они обладают свойствами молекулярных сит.

Метод ТСХ позволяет разделять смеси аминокислот, белков, нуклеотидов, липидов, смеси моно- и олигосахаридов. В настоящее время ТСХ занимает одно из ведущих мест среди методов разделения биоорганических веществ.

Ионообменная хроматография основана на различной способности разделяемых ионов к ионному обмену с фиксированными ионами сорбента, образующимися в результате диссоциации ионогенных групп сорбента.

Для разделения катионов используют катиониты, анионов – аниониты. Элюентом в первом случае служит раствор кислоты, во втором – раствор щелочи.

Ионообменная хроматография применяется для разделения катионов и анионов, аминов, аминокислот. Высокоэффективная ионнообменная хроматография смесей нуклеотидов, нуклеозидов, пуриновых и пиримидиновых оснований и их метаболитов в биологических жидкостях (плазма крови, моча, лимфа) используется для диагностики заболеваний. Белки и нуклеиновые кислоты разделяют с помощью ионнообменной хроматографии на гидрофильных высокопроницаемых ионитах на основе целлюлозы, декстранов, синтетических полимеров, широкопористых силикагелей.

Молекулярно-ситовая (гель-хроматография) (ситовая хроматография). В отличие от распределительной хроматографии в гель-хроматографии подвижной и неподвижной фазами служит одна и та же жидкость-растворитель. Та часть жидкости, которая протекает вдоль слоя твердого носителя - зёрен геля, выполняет функцию подвижной фазы и переносит компоненты смеси вдоль колонки. Другая часть этой же жидкости проникает в поры зёрен геля и выполняет функцию неподвижной фазы.

Разделение смеси веществ в гель-хроматографии (рис. 9) происходит, если размеры молекул этих веществ различны. При фильтровании раствора смеси веществ более мелкие молекулы, проникая в поры геля, задерживаются в растворителе, содержащемся в порах, и движутся вдоль слоя геля медленнее, чем крупные молекулы, не способные проникать в поры.

В хроматографии применяют широкий ассортимент гелей: это декстрановые гели (сефадекс), полиакриламидные гели, оксиалкилметакрилатные гели, гели агарозы (полисахариды из агар-агара).

Основное применение гель-хроматографии в биохимии - разделение смесей высокомолекулярных веществ в зависимости от размеров и молярной массы веществ. С помощью этого метода выделяют и очищают белки, нуклеиновые кислоты, клетки (эритроциты, лимфоциты).

М олекулы разделяемой смеси

Гель

Рис. 9. Схема разделения смеси двух веществ разной молекулярной массы в гель-хроматографии (от момента ввода смеси до выделения

компонентов смеси из колонки)

Биоспецифическая (аффинная) хроматография - это метод очистки и разделения белков, основанный на их избирательном взаимодействии с лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем.

В качестве лигандов используют соединения, взаимодействие которых с разделяемыми веществами основано на их биологической функции. Например, при разделении ферментов (для чего преимущественно и применяется аффинная хроматография) лигандами служат их субстраты, ингибиторы или коферменты.

Неподвижная фаза в аффинной хромотографии представляет собой специально получаемый сорбент, построенный по схеме: носитель – соединяющее звено («ножка») – специфический лиганд. Носителем служит сефаропроизводные агарозы, макропористые неорганические носители (кремнезем, стекло) и органические полимеры. Если лиганд присоединяется непосредственно к носителю, эффективность взаимодействия с ферментом снижается вследствие пространственных затруднений. «Ножка» устраняет стерические препятствия, отделяя лиганд от носителя. В качестве «ножки» используют ди- и полиамины, пептиды, олигосахариды. Лигандами служат субстраты, например, крахмал или гликоген при разделении амилаз.

Помимо ферментов методом аффинной хроматографии можно выделять также токсины, рецепторы, ингибиторы, транспортные белки и другие, биологически активные вещества.