1.1.4.Минимальный размер генома одноклеточных организмов

Определение минимального размера генома, обеспечивающего все необходимые функции, которые позволяют одноклеточному организму существовать в определенных экологических условиях, не является праздным вопросом. Решение этой проблемы необходимо для понимания происхождения жизни на Земле, а также путей и механизмов совместного эволюционирования генов, объединенных в конкретные геномы, а следовательно, и механизмов возникновения геномов как таковых. Данная проблема была впервые сформулирована Дж. Холдейном в 1920-е годы и с тех пор неоднократно исследовалась. Недавнее (1995 г.) определение полных первичных структур ДНК геномов двух паразитических микроорганизмов (Mycoplasma genitalium и Haemophilus influenzae) дало возможность использовать новый подход для изучения данной проблемы. А.Р. Мушегианом и Е.В. Куниным проведен детальный сравнительный анализ полного набора генов этих микроорганизмов, который позволил составить перечень генов, абсолютно необходимых для существования свободно живущих клеток.Считается, что геномы M. genitalium и H. influenzae произошли путем последовательного уменьшения размера генома соответственно грамположительных и грамотрицательных бактерий-предшественников с более крупными геномами после отделения их предков от общего предшественника не менее 1,5 миллиардов лет назад. Предполагается, что общие гомологичные гены, сохранившиеся у этих микроорганизмов на протяжении столь длительного периода их существования, являются жизненно важными и составляют основу минимального набора генов, необходимых для автономного существования паразитических клеток. На основе анализа последовательностей нуклеотидов предсказано, что геном M. genitalium, длина которого составляет ~580 т.п.о., кодирует 469 белков, тогда как геном H. influenzae (~1830 т.п.о.) кодирует 1703 белка. Оказалось, что геном M. genitalium содержит в своем составе 240 генов, имеющих функциональные гомологи в геноме H. influenzae. При теоретической разработке идеального абстрактного генома к набору было добавлено 22 гена, необходимых для осуществления жизненно важных метаболических процессов, которые у этих двух микроорганизмов контролировались негомологичными генами. Одновременно из набора были удалены 6 генов, избыточных с точки зрения выполняемых ими функций, которые обеспечивают специфическое взаимодействие микроорганизмов с хозяевами. Оставшиеся 256 генов, по мнению авторов теоретической разработки, полностью перекрывают потребности абстрактного паразитического микроорганизма. Предлагаемый гипотетический минимальный набор генов, кодирующих 256 белков, должен включать следующие жизненно важные генетические системы микроорганизмов: почти полный набор генов системы трансляции; почти полный набор генов системы репликации; гены рудиментарной системы репарации и рекомбинации; гены аппарата транскрипции, в котором отсутствуют почти полностью гены регуляции транскрипции; большой набор генов, кодирующих белки, гомологичные шаперонам; гены, контролирующие анаэробный метаболизм, включая гены гликолиза и фосфорилирования субстратов; гены биосинтеза липидов; восемь генов, кодирующих ферменты, которые используют сложные кофакторы; гены системы транспорта белков; ограниченный набор генов, обеспечивающий транспорт метаболитов; полный набор генов утилизации нуклеотидов de novo и гены их биосинтеза; гены биосинтеза аминокислот не включены (поскольку предполагается паразитический образ жизни).Ранее были использованы еще два подхода для определения минимального размера генома, необходимого для автономного существования микроорганизмов. В одном из них путем введения случайных мутаций определялось число генетических локусов у Bacillus subtilis, несущественных для ее выживания. На основании результатов этих исследований сделан вывод о том, что средний размер минимального генома составляет 318 т.п.о., а его максимальный размер приближается к 562 т.п.о. Полученные значения согласуются с величинами, характерными для M. genitalium. При другом подходе изучались изменения размера генома при переходе от свободно живущих клеток к облигатным внутриклеточным паразитам и органеллам эукариот. При этом риккетсии рассматривались как эволюционные предшественники митохондрий. Работа еще не завершена, поскольку полной первичной структуры генома риккетсий пока не получено.Таким образом, исследования, проведенные на геномах M.genitalium и H. influenzae, дают в настоящее время наиболее точную оценку минимального набора генов (~ 250), необходимых для существования микроорганизмов. Эти результаты будут корректироваться по мере накопления экспериментальных данных о структуре других геномов, что позволит в каждом конкретном случае определять набор именно тех генов, которые делают любой организм уникальным

36,

ДНК в различной степени деградации может сохраняться в останках ископаемых организмов. Большинство ископаемых это кости но не старше 100 млн. лет. Гораздо больше ДНК и лучшего качества можно выделить из мягких тканей, сохраненных при заморозке, например ,мамонта. Волосы- идеальный источник, так как они разлагаются меньше всего.

Сложности секвенирования ДНК:

1.ДНк в очень малых количествах

2.присутствуют примеси в больших количествах ДНК грибов и бактерий

3.За миллионы лет могут происходить химические реакции, и может поменяться последовательность

4. можно использовать только 2 или 3 поколение методик

Очень многих случаях происходит деаминирование ДНК (из цитозина в урацил).

Только маленькое определение последовательности ДНК мамонта мешает вернуть вид к жизни, хотя кроме этого уже все имеется(разобрали только около 70%).

Наиболее успешным палеогеномных проектом является геном древнего эскимоса. ДНК из волос человека жившего около 4000 лет назад. Секвенирование на секвенаторах 2 поколения. Средняя длина одиночного прочитанного фрагмента ДНК- 48 н.п. Собрано 79% последовательности ДНК. Было выяснено что у человека были карие глаза,темные волосы, кровь группы А и его метаболизм был подстроен под холодный климат.

Геном неандертальца ещё в проекте, но секвенировано уже 79%.. Основная масса данных получена всего лишь из 3 костей найденных в Норвегии.

Для предотвращения загрязнения образцов принимались меры предосторожности. Люди работали в стерильных условиях, иначе ДНК могли смешаться почти на 40 %.

35.

Метагеном- полная генетическая информация сообщества организмов(геном-полная генетическая информация организма). Матагеномика исследует природные сообщества микроорганизмов путем секвенирования их ДНК. 3 периода в развитии микробиологии

1.1660-е Левенгук- изобретение микроскопа и первые наблюдения за микроорганизмами:200 лет описательной микробиологии.

2.1880-е Роберт Кох- чистые культуры:100 лет аналитической микробиологии.

3.1980-е – отказ от чистых культур:30 лет системной микробиологии(2004-добавление метагеномного подхода).

Большая часть организмов на пленете имеет микроскопический размер. Микрооргнанизмы есть практически везде. В наших телах клеток бактерий как минимум в 10 раз больше чем клеток человека. Подавляющее большинство микроорганизмов культивировать в лаборатории невозможно. Мы не знаем даже о самом факте существования большинства видов на планете,тем более о биологической роли. Даже если культивировать микроорганизмы невозможно мы все равно можем выделить из них ДНК. Если ДНК есть то можно выделить ее последовательность. Зная последовательность, можно понять таксономию организма и его биологические свойства.

Но проблема этого подхода - в естественной среде обитания микроорганизмы существуют в сложных сообществах из многих видов в значительной степени схожих, и поэтому полные последовательности отдельных видов собрать очень тяжело.

Основная проблема метагеномики- сборка полных геномов при анализе сложных сообществ. Основной объект метагеномики- гены, а не геномы. Метагеномика может использовать только шотган- подход к секвенированию. Это приводит к тому,что на сегодняшний день сборка полных геномов конкретных организмов при анализе метагенома невозможна. По этой причине метагеномика делает акцент на генах а не на геномах.

Основные вопросы метагеномики

1.Какие организмы присутствуют в сообществе?

2.Как эти организмы взаимосвязаны и как функционирует сообщество в целом?

3.Какую пользу человек может получить от этих организмов?

Облати применения метагеномики

1.Получение информации о все формах жизни на пленете

2.Обнаружение новых ферментов и метаболитов

3.Исследование влияния загрязнений на экосистемы и выявление сообществ,способных к очистке загрязненных экосистем

4.Иссследование влияния микробиома человека на его здоровье

2 направления метагеномики.

1.с основыным акцентом на гены

2.с акцентом на функции

34

Конечная цель синтетической геномики- создание синтетических геномов с заданными свойствами. Основные задачи:

1.Выявление минимального набора генов,необходимого для функционирования клетки

2.Синтез полных последовательностей в пробирке

3.Замещение ДНК на синтетическую

4.Создание геномов с заданными свойствами

Кака определить минимальный геном?

1.Компьютерный анализ. Самый простой способ- тщательный анализ многих геномных последовательностей для выявления универсально консервативных генов,которые скорее всего являются обязательными для функционирования клеток.

Проблемы подхода:

-оценка минимального числа генов может быть занижена в 2 раза

-упускается слишком много генов

-подход предлагает гипотезу которую надо проверять

2.Генетический подход. Подход экспериментальный поэтому более надежный,но более трудоемкий. Методы: мутагенез(бактерии),рекомбинация(дрожжи), РНКи(эукариоты).

недостатки:

-даже в самом маленьком геноме многие жизненные важные гены дублируются,поэтому их одиночная инактивация не имеет эффекта,но совместная имеет.

-ни один из методов инактивации не дает 100% гарантии выключения гена

3.Биохимический метод. Клеточные субсистемы,относительно охарактеризованные:

-репликация ДНК

-транскрипция

-процессинг РНК

-трансляция

4. Синтез. Если клетка с синтетическим геномом живет и делится- все жизненно важные гены есть. Проблемы:

-чтобы такой геном создать нужно точно знать какие гены в него должны быть включены

-в первых синтетических геномах наверняка останется сного лишних генов

- техническм сложно.

Зачем создавать синтетические геномы?

1. Понимание биологии клетки

2. Биотехнология: из синтетического генома можно убрать все ненужные метаболические пути и, наоборот, добавить необходимые

3. Безопасность: синтетический геном дает возможность создать клетку,гарантированно неспособную существовать вне лаборатории.

33.

Гены растений компактны:содержат короткие интроны и небольшое количество экзонов.Средняя длина гена- 2,5-3,5 т.н.п.

Генов много-обычно не менее 40-50 тыс (в гаплоидном геноме.Количество белков ненамного превышает количество генов.

Растения часть полиплоидны,причем полиплоидизация в ходе эволюции происходила много раз,поэтому многие гены неоднократно дублируются.

Геномы растений варьируют в очень широких пределах( исчесляются в млрд).

Результатом многократных полиплоидизаций является присутствие в геномах растений большого количества дуплицированных генов.

Геномы растений насыщены повторами.

Типы повторов:

-транспозоны(широкий спектр различных свойств,могут занимать значительную часть генома)

-саттелиты(микро- и минисаттелиты могут занимать до половины генома)

-теломерные повторы(теломеры и субтеломерные повторы)

-центромерные и перицентромерные области)

-повторы генов рибосомной РНК(копии генов по всему геному)

-тандемные дупликации генов.

Транспозоны в геномах растений:занимают от 10-80%,расположены в межгенных участках.

Растения способны синтезировать более 100000 вторичных метаболитов-соответствующие гены могут составлять 20-30 и более % общего числа генов растений. Наибольшие отличия от животных-среди регуляторных генов. Обычно около 80% всех регуляторов специфичны для растений.

Внеядерная часть генома растений гораздо важнее,чем у животных.

32.

Нуклеотидная последовательность на 97.5% идентична Homom sapiens

Отличия от Homo sapiens: 35 млн нуклеотидных замен,5 млн делеций,некоторые хромосомные перестройки.

29%белков идентичны,а в среднем по 2 аминокислотныен замены на белок.

Какие гены делают человека человеком? отобрано 585 таких генов(4.4 %),однако изза низкой степени дивергенции двух видов около половины таких отклонений могут быть случайными. Примеры наиболее отличающихся белков:Гликоферин С(необходим для инфекции эритроцитов),гранулизин(защита от внутриклеточных патогенов),протамины и семеногелины(репродукция).

31.

2000- «черновик»генома: около 90% эухроматина,150000 разрывов,масса ошибок веквенирования и сборки

2003-«закончена» эухроматиновая часть генома: 2.85 млрд н.п.(99% эухроматина)

остался 341 разрыв,частота ошибок порядка 0.00001

2006-завершена публикация «окончательного» сиквенса отдкльных хромосом:1999-сиквенс первой хромосомы(№22),2006-сиквенс последней(№1).

Статистика «завершенного» сиквенса человека: 2.85 млрд н.п.,20000 кодирующих белок генов,не менее 40% генома-интроны.

Геном некоторых рыб меньше человеческого почти в 10 раз.Количество генов:не более 25000,компактность генома достигнута за счет малого размера интронов.

Интроны человека длиннее интронов животных. Экзоны человека короче экзонов животных.

№ 25 . Характерные черты геномов прокариот.

Прокариоты – микроскопические одноклеточные организмы, с min морфологическим разнообразием

Основные свойства прокариот :

• Компактность ( min некодирующей ДНК 5-10% ; в основном без интронов)

• Высокая мобильность за сет горизонтального переноса

• Геном представлен однокольцевой или линейной хромосомой размером 0.5 – 10 м н.п, могут иметь несколько кольцевых или линейных плазмид ( плазмиды отличаются от хромосомы тем, что она может быть утрачена без потери клеткой жизнеспособности)

Плазмиды имеют размер от нескольких тысяч до десятков тысяч нуклеотидных пар

• Средний размер гена -1т.н.п

• Обычное кол-во генов 3-5 тыс

• Размер генома 2-5 млн н.п

Традиционно бактериальные геномы представляются в виде колец

Первые 2 кольца – ГЦ –перенос – показывает в какую сторону транскрибируется большинство генов и позволяет определить точку начала инициации и репликации , а так же точку терминации репликации

Формула для ГЦ переноса : (% Г пар -% Ц пар) / сумма % ГЦ пар показывает насколько богата ГЦ парами часть генома

Третье кольцо –ГЦ состав ( суть –показать фрагменты ДНК, которые имеют чужеродные происхождения)

• САМЫЙ БОЛЬШОЙ ПРОКАРИОТИЧЕСКИЙ ГЕНОМ У SORANGIUM CELLULOSUM

Размер 13,033 779 н.п ( одна кольцевая хромосома )

Содержание ГЦ пар -71.38 %

Max размер гена 25.254 н.п

Средний размер гена 1206.05 н.п

Число генов , кодирующих белки -9.367

№ 26 Характерные черты геномов факультативных и облигатных патогенов. Взаимная

адаптация геномов патогена и его хозяина.

Структура геномов факультативных и облигатных патогенов принципиально отличается

	Геном факультативного патогенна	Облигатного патогенна
Размер	Большой ( более 5 млн н.п)	Небольшой ( 0.5 -2 млн н.п)
Метаболические возможности	Разнообразные	Ограниченные
Число регуляторных генов	Большое ( сотни)	Маленькое ( единицы, десятки)
Содержание ГЦ пар	Высокое	низкое
Кол-во транспозонов	Десятки , сотни	Единицы

№ 27 Разнообразие и характерные особенности геномов одноклеточных эукариот

• Пивные дрожжи – вегетативное размножение путем деления ( s. Pomble)

• Хлебные дрожжи –почкование ( s. Cerevisiae)

	s. Pomble	s. Cerevisiae
Размер генома	13.8	13.6
Число хромосом	3	16
Число генов, кодирующих белки	4.929	5570
% генов с интронами	43	4
Плотность генов	1/ 2800	1/ 2500
% генома, кодирующего белки	57.5	70
Число генов тРНК	174	275
Число повторов рРНК	120	140
Число транспозонов	11 ( 0.35%)	59 ( 2.4 %)

№ 29 НЕМАТОДЫ

Развитие каждой клетки нематод жестко детерминировано. Геном нематоды ( С.elegans) имеет размер 100млн.н.п

Последовательность генома собрана из :

• число генов 1900

• ген РНК- 877 мРНК

• геном был секвенирован с использованием космид – 17 000 и дрожжевых хромосом -3 000 YAC последовательностей

Доменная организация белков :

1. большинство генов используется в клетках коммуникации ( G –белки, рецепторы)

транссплайсинг -способность считывать информацию со внутренних рамок считывания, путем разрезания по механизму сплайсинга

• в 1 гене – 6 экзонов ( размер 300 н.п) и размер интронов ( 57 н.п)

• средний размер гена – 2 тыс н.п

• 27 % кодирующей ДНК

№ 30 Общие характеристики генома Drosophila melanogastres

• Размер генома -180 млн. н.п ( 120 Mb –эухроматин; 60 –гетерохроматин )

Эухроматин – беден генами , богат транспозонами и др. повторами, интенсивно окрашивается, окружает центромерные области

• Геном богат повторами => используется 3 типа библиотек

А) мультикопийные плазмиды со вставками размеров 2 kb

Б) плазмиды со вставками размером 10 kb

В) 130 kb ВАС-клоны секвенированы с концов и использованы для стыковки фрагментов генома между собоц

• В геноме 14 тыс генов

• Экзонв 4-5 ( размер 150 н.п)

• Интроны ( 60 н.п)

• Средний размер гена 3800 н.п

• 19 % кодирующей ДНК

1