59. Генная инженерия. Трансгенные организмы.

Генетическая инженерия – совокупность методов создания живых генетически измененных организмов, включающих чужеродный генетический материал.(клеточная, хромосомная, генная) Часто ее отождествляют с генной инженерией (ГИ) – создание генетических измененных организмов в результате целенаправленного переноса в них чужеродных генов, кодирующих нужные человеку признаки и свойства. В основе ГИ лежит способность рестриктаз бактерии расщеплять ДНК. Дата рождения ГИ 1972 г. Группа Берга получила первую рекомбинантную ДНК вкл: часть генома умеренного бактериофага λ, гены лактозного оперона кишечной палочки, полный геном онкогенного вуруса обезьян SV40. Технология переноса трасгенных – чужеродных генов и их передача в ряду поколений называется трансгенезом. Направленный перенос может осуществлятся м/у далекими филогенетическими группами. Организмы получившие в их геном чужеродные гены – трансгенные или генетически модифицированные. Процесс когда чужеродная ДНК проникает в реципиентную к-ку и вызывает у нее наследуемые изменения – трансформация. У бактерий трансформация может осуществлятся с помощью растворимых фрагментов ДНК, а у эукариот только векторы. Этапы:

1. Получение нужного гена. Из естественных источников или геномной библиотеке. Синтезирован искусственно: химическим путем или ферментативным по принципу обратной транскрипции. Или с помощью полимеразной цепной реакции.

• Создание вектора. Вектор – молекулы ДНК, способные переносить включенные в них чужеродные гены в к-ку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом. Свойства вектора:

• Способность к автономной репликации в к-ке. (для бактерй должен содержать сайт ori – участок инициации репликации)

• Наличие сайта в котором возможно встраивание желаемого фрагмента. Для этого должен содержать участки, чувствительные к определенной рестриктазе, которая расщепляет вектор и позволяет встроить трансген.

• наличие маркерных генов (селективные гены – устойчивость к чему то, репортерные – дают продукт удобный для тестирования).

• Для экспрессии нужно поместить под соответствующей промотор (обычно бактериальный лактозный промотор кишечной палочки)

В качестве векторов используют плазмиды – внехромосомные гененетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетке, ДНК бактериофагов, искусственные векторы – космиды.

2. Трансформация.

3. Молекулярная селекция – отбор клонов, несущих рекДНК. Использование маркерных генов, находящиеся в векторной молекуле.

4. Выращивание измененных клеток в целые трансгенные организмы.

Схема опыта по ГИ. Дорисовать.

1 и 2 Для конструирования рекДНК векторную и чужеродную ДНК, содержащую нужный ген разрезают рестриктазой (одной и той же). Образуются одинаковые «липкие» концы.

3. Смешивание различных по происхождению фрагментов ДНК и сшивание ДНК-лигазой. Липкие концы чужеродной ДНК и плазмиды взаимодействуют др с др, образуя комплементарные пары оснований. Происходит гибридизация векторной и чужеродной ДНК. Липкие концы замыкаются с помощью водородных связей, а ковалентные сшиваются ДНК-лигазой.

4. Генетическая трансформация, перенос и включение рекДНК, содержащей трансген, в клетки реципиенте. Плазмида, встроенная в бактерию, ведет себя как вектор (переносчик) нового гена, который реплицируется в каждом новом поколении

5. Молекулярная селекция – отбор трансформантов, клонов несущих рекДНК. Образуются 3 типа клеток: не содержащие плазмиду, содержащие плазмиду без встройки (без рекДНК), содержащие плазмиду с рекДНК. Для отбора используются маркерные гены.

Значение ГИ: медицина (инсулин), устойчивость к насекомым, повышение урожайности, увеличение сроков хранения, биореакторы.