Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот
.pdfОГЛАВЛЕНИЕ
|
Часть первая |
|
|
|
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ |
|
|
Введение .................. |
|
3 |
|
Глава 1 |
|
|
|
Гели для электрофореза .................. |
|
7 |
|
Полиакриламидный гель (ПААГ) ................ |
|
7 |
|
|
Исходные материалы ................... |
|
7 |
|
Процесс полимеризации ПААГ ............... |
|
10 |
|
Выбор концентраций мономеров .............. |
|
13 |
Агароза ......................... |
|
16 |
|
Смешанный гель (агароза+ПААГ) .............. |
|
20 |
|
Ацетатцеллюлозная пленка, импрегнированная ПААГ ....... |
21 |
||
Глава 2 |
|
|
|
Техника приготовления гелей и аппаратура ........... |
21 |
||
Вертикально расположенные трубки -.... .......... |
: |
21 |
|
Вертикально расположенные пластины .............. |
|
26 |
|
Горизонтально расположенные пластины ............ |
|
32 |
|
Глава 3 |
|
|
|
Электрофорез белков .................... |
|
37 |
|
Замечания общего характера .................. |
|
37 |
|
|
Миграция белков в геле ................. |
|
37 |
|
Напряженность электрического поля (H) ......... |
38 |
|
|
Выбор буфера рабочего геля ............... |
|
40 |
|
Выделение тепла при электрофорезе ............ |
|
42 |
|
Загрузка геля. Ширина белковых зон ............ |
|
44 |
|
Введение мочевины и (З-меркаптоэтанола. Некоторые артефакты . |
46 |
|
|
Лидирующие красители ................. |
|
47 |
Разделение белков по размерам и заряду ............ |
|
48 |
|
|
Выбор рабочего буфера ................. |
|
48 |
|
Использование мочевины ................. |
|
50 |
|
Загрузка геля и подготовка препарата .. |
;......... |
52 |
|
Некоторые примеры ................... |
|
53 |
Разделение белков по размеру с использованием ДДС-Na ..... |
56 |
||
|
Существо метода ..................... |
|
56 |
|
Выбор пористости геля .................. |
|
59 |
|
|
283 |
|
Присутствие мочевины и нейояных детергентов ........ |
60 |
|
Выбор рабочего буфера геля ............... |
|
61 |
Подготовка белкового препарата |
.............. |
6в |
Проведение электрофореза ......... |
;...... |
63 |
Окрашивание и элюция белков .............. |
|
64 |
Ступенчатый электрофорез (disc-electrophoresis) ......... |
66 |
|
Градиент пористости ПААГ .................. |
|
73 |
Двумерный электрофорез в ПААГ ................ |
|
76 |
Электрофорез с использованием Тритона Х-100 в цетавлона .... |
83 |
|
Тритон Х-100 ..................... |
|
S3 |
Цетавлон ................. |
|
85 |
Окрашивание белков в ПААГ ................ |
|
88 |
Кислые красители ................... |
|
90 |
Другие красители и методы окрашивания .......... |
94 |
|
Флюоресцентные красители ................ |
|
97 |
Локализация ферментов после электрофореза ......... |
101 |
|
Локализация белковых полос осаждением ДДС-Na . .... . . |
104 |
|
Элюция белков из геля ............. |
|
105 |
Определение радиоактивности белков после электрофореза в ПААГ . |
109 |
|
Счет радиоактивности в элюатах белка ........... |
109 |
|
Растворение ПААГ .................... |
|
110 |
Импрегнирование сцинтиллятора в гель ........... |
111 |
|
Авторадиография .................... |
|
112 |
Флюорография ..................... |
|
113 |
Препаративный электрофорез белков .............. |
116 |
|
Глава 4
Электрофорез нуклеиновых кислот………………………………………………………...
120
Замечания общего характера…………………………………………………………………..120 Выбор буфера геля и напряженности электрического поля……………………………..120 Выбор характера геля и его пористости………………………………………………….121 Влияние вторичной структуры……………………………………………………………123 Маркерные молекулы……………………………………………………………………...125
Лидирующие |
красители…………………………………………………………………… |
|
126 |
Электрофорез в мягких условиях……………………………………………………………...126 Фракционирование плазмид и фрагментов ДНК…………………………………………126 Фракционирование РНК…………………………………………………………………...
128
Электрофорез в денатурирующих гелях………………………………………………………128 Щелочные гели……………………………………………………………………………..
129 Гели, содержащие мочевину. Секвенирование ДНК и РНК……………………………..131 Денатурирующие гели с формамидом……………………………………………………135
Денатурирующие гели с формальдегидом……………………………………………….138 Гели, содержащие гидроокись метилртути………………………………………………140 Денатурация нуклеиновых кислот глиоксалем…………………………………………..
142 Использование градиентов пористости ПААГ……………………………………………….142
Двумерный электрофорез нуклеиновых кислот и их фрагментов…………………………..144 Некоторые особые случаи электрофореза нуклеиновых кислот…………………………….147
Электрофорез в геле агарозы тройного комплекса ДНК—РНК-поли- мераза—РНК………………………………………………………………………………...
147
284
Выявление мРНК при электрофорезе суммарной РНК в геле агарозы 148 Использование жидкого (не сшитого) ПААГ……………………………………………….
149 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Окрашивание нуклеиновых кислот после электрофореза ...... |
150 |
|
|
|
||||
Элюция нуклеиновых кислот из гелей ............. |
|
153 |
|
|
|
|
||
Элюция из ПААГ за счет диффузии ............ |
|
153 |
|
|
|
|
||
Элюция из гелей агарозы ................ |
154 |
|
|
|
|
|
||
Электрофоретическая элюция ............... |
158 |
|
|
|
|
|||
Перенос нуклеиновых кислот из геля на нитроцеллюлозные фильтры |
|
|
||||||
и диазобумагу ..................... |
|
162 |
|
|
|
|
|
|
Определение радиоактивности ................ |
165 |
|
|
|
|
|
||
Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот ........ |
166 |
|
|
|
||||
Литература ....................... |
|
168 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Часть вторая |
|
|
|
|
||
|
|
УЛЬТРАЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ |
|
|
|
|||
Введение ......................... |
|
174 |
|
|
|
|
|
|
Глава 1 |
|
|
. |
|
|
|
|
|
Основные понятия теории седиментации ............ |
175 |
|
|
|
|
|||
Глава 2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Ультрацентрифуга ..................... |
|
177 |
|
|
|
|
|
|
Принцип действия и расположение важнейших узлов ....... |
177 |
|
|
|
||||
Проверка готовности основных систем к пуску |
.......... 179 |
|
|
|
||||
Пуск центрифуги ...... |
.............. 180 |
|
|
|
|
|
|
|
Глава 3 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Роторы и пробирки .................... |
|
182 |
|
|
|
|
|
|
Угловые роторы ....................... |
|
182 |
|
|
|
|
|
|
Пробирки для угловых роторов .............. |
184 |
|
|
|
|
|
||
Уход за роторами и пробирками .............. |
187 |
|
|
|
|
|
||
Роторы со свободно подвешенными пробирками (бакет-роторы) . . . |
189 |
|
|
|||||
Роторы с вертикальными пробирками .......... |
'... |
191 |
|
|
|
|
||
Максимально допустимая частота вращения ротора ........ |
191 |
|
|
|
||||
Зональные роторы ..................... |
|
193 |
Особенности эксплуатации и ухода |
' |
197 |
|||
|
|
|
||||||
Глава 4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Раздельное осаждение частиц (дифференциальное центрифугирование) 199 |
|
|
||||||
Глава 5 |
|
|
|
|
|
|
|
|
Зонально-скоростное центрифугирование ............. |
201 |
|
|
|
|
|||
Константа седиментации |
.................. 203 |
|
|
|
|
|
|
|
Изокинетический градиент плотности ............... |
|
204 |
|
|
|
|
||
Выбор среды ............ |
ь .......... |
206 |
|
|
|
|
|
|
Характеристики растворов сахарозы ............... |
213 |
210 |
|
|
|
|
||
Профиль градиента сахарозы ................. |
|
|
|
|
|
|||
Создание градиента плотности сахарозы |
............ |
214 |
|
|
|
|
||
|
|
|
Наслоение препарата на градиент ........ |
i .... |
219 |
|||
|
|
|
285 |
|
|
|
|
|